含有利塞膦酸锌铝的佐剂及其应用制造技术

本申请涉及一种含有利塞膦酸锌铝的佐剂，一种包含所述佐剂和免疫原的免疫原性组合物，以及所述佐剂和免疫原性组合物的用途。以及所述佐剂和免疫原性组合物的用途。以及所述佐剂和免疫原性组合物的用途。

【技术实现步骤摘要】
含有利塞膦酸锌铝的佐剂及其应用


[0001]本申请涉及生物制药
具体地，本申请涉及一种含有利塞膦酸锌铝的佐 剂，一种包含所述佐剂和免疫原的免疫原性组合物，以及所述佐剂和免疫原性组合物 的用途。
技术背景
[0002]佐剂是一类能与免疫原特异或者非特异性结合，并刺激诱导机体产生长期有效的 特异性免疫应答的物质或混合物。佐剂的免疫生物学作用包括降低免疫原的使用量、 增强抗原的免疫原性、改变免疫应答类型等。目前被批准用于人用疫苗的佐剂有铝佐 剂、MF59、AS04、AS01
B
、CpG1018等，并有数种新型佐剂处于临床试验阶段，其包括： AS03、RC
‑
529、Advax、Matrix
‑
M等。铝佐剂是第一个被批准用于人用疫苗的佐剂， 至今已有近90年的使用历史，是公认的应用最为广泛、安全、有效的佐剂。然而，随 着疫苗研究品种的增加，发现铝佐剂刺激诱导Th2类免疫优势应答，在诱导产生Th1 类免疫应答上作用有限，这也限制了铝佐剂在治疗性疫苗中的应用，比如水痘带状疱 疹病毒疫苗、乙肝治疗性疫苗以及肿瘤疫苗等。并且，与许多新型疫苗佐剂相比，铝 佐剂活性较弱，对类病毒颗粒抗原以外的其它大多数基因工程抗原免疫增强作用不理 想，使其在非多聚化蛋白抗原疫苗中的应用受到限制。
[0003]含铝佐剂系统是指以铝佐剂为基础，与其他佐剂成分或递呈系统(如MPL、CPG、 QS21和脂质体等)形成的佐剂系统，可诱导相对平衡的Th1和Th2免疫应答。目前已 有数种含铝佐剂系统批准上市或进入临床试验(NPJ Vaccines.2018，10；3：51.). 例如，由葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline，GSK)研发的AS04，该佐剂系统是在铝 佐剂的基础上添加TLR
‑
4(Toll like receptor 4，TLR4)激动剂：3
‑0‑
去酰基
‑4’‑ꢀ
单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipid A，MPL)，因其氨基葡萄糖磷酸化，与Al
3+
有 很高的亲和力，被铝佐剂吸附形成复合型佐剂，其可提高抗原特异性CD4
+
T细胞γ
‑ꢀ
干扰素(Interferon
‑
γ，IFN
‑
γ)的表达(IFN
‑
γ为T细胞应答的重要指标之一)。 目前AS04已成功应用于乙肝疫苗(Fendrix，2005获批上市)和HPV16/18双价宫颈 癌疫苗(Cervarix，2007获批上市)中。相较于单独使用铝佐剂而言，其可明显提高 HPV16/18双价宫颈癌疫苗(Cervarix)中和抗体滴度并延长免疫保护有效期，并且该 疫苗免疫一或两次可产生类似于免疫三针次所提供的保护效果。CpG，为TLR
‑
9的受体 激动剂，其与铝佐剂联合作为疟疾疫苗佐剂、钩虫疫苗佐剂已进入临床试验中。
[0004]铝佐剂与抗原的吸附作用是其免疫增强机制的原因之一。配体交换是佐剂和抗原 间最强的一种相互作用力，由抗原中的磷酸基团与氢氧化铝或者磷酸铝中的羟基基团 发生配体交换而产生，此为专利技术人Zhao在2001年提出的铝佐剂白表面“亲磷性”的 概念(Analytical Biochemistry，2001，295(1)：76
‑
81)。前述的AS04，MPL通过磷 酸基团与铝佐剂吸附而形成新型的复合佐剂在临床中已得到了很好的应用。
[0005]双膦酸盐(Bisphosphonates，BPs)药物是一类以P
‑
C
‑
P为中心骨架的人工合成 焦磷酸类似物，为有机双膦酸，因其含有磷酸基团使得与钙、铝、锌、镁等离子具有 高度亲和力，被用于骨疾病、钙代谢性疾病的治疗，例如骨质疏松症，变形性骨炎， 恶性肿瘤骨转移
引起的高钙血症和骨痛症等。同时，临床研究显示将双膦酸药物用于 多发性骨髓瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等的辅助治疗可降低患者骨相关疾病的发生 率，癌症复发率以及提高患者的存活期并改善临床结局。除此之外，双膦酸因具有免 疫正向调节作用而表现出佐剂活性，其作为免疫增强剂被用于疫苗制剂的专利专利技术亦 有报道(中国专利：CN103768595B；美国专利：US20170281759A1；中国专利：CN 108289902A)。双膦酸药物在临床上通常采用口服或静脉注射给药，其具有较强的粘 膜刺激作用，而在疫苗的使用中，通常以肌肉注射的方式进行免疫。然而，双膦酸具 有潜在的副作用，仍需要进一步改进。
[0006]冠状病毒(Coronavirus，CoV)是一种具有包膜的、非节段的单股正链RNA病毒， 属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，正冠状病毒亚科 (0rthocoronavirinae)，被分为α、β、γ和δ四个属.截止目前为止，发现有7 种冠状病毒可感染人类，其中以季节性流行为主的冠状病毒包括：α属的229E和NL63， β属的0C43和HKU1，以及大流行冠状病毒：严重急性呼吸综合征相关冠状病毒 (SARS
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CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS
‑
CoV)和新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)。 目前已知冠状病毒可感染人、鼠、猪、猫、犬、水貂、豚鼠、地鼠、恒河猴以及禽类 等脊椎动物，同时荷兰病毒学家证实新型冠状病毒可由人类传播给水貂再传回给人类， 证实新型冠状病毒动物传人传播链。SARS
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CoV、MERS
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CoV以及SARS
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CoV
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2具有较强 的传播能力和致病性。目前新型冠状病毒的全球大流行，给人们的生命健康安全和社 会活动造成重大威胁并引起巨大的经济损失，而疫苗是控制和预防该病毒感染的最有 效手段。
[0007]冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)是一种I型跨膜蛋白，由S1和S2蛋白亚基两部分 组成，介导与宿主细胞表面受体的结合和细胞膜的融合以进入靶细胞。多项证据表明， 针对刺突蛋白的抗体可能在新型冠状病毒性肺炎的免疫预防和治疗中发挥关键作用， 是目前新型冠状病毒重组蛋白疫苗研制和设计的关键靶点。有研究发现，急性新型冠 状病毒感染会使其长效的中和抗体反应减弱，但仍可通过病毒特异性记忆T细胞实现 免疫记忆(Cell，2020，183(1)：13
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15)，说明T细胞应答在预防新型冠状病毒感染 的重要性。重组DNA技术表达制备的亚单位蛋白疫苗具有较好的安全性，并可实现多 针次加强免疫，但其免疫原性较弱。同时，世界卫生组织(WHO)与2020年4月份制 定了COVID
‑
19疫苗的目标产品特性，疫苗须快速起效，在2周内可提供保护，同时1 针实现基础免疫，并不超过2剂的给药方案，同时在保护持久性上要求至少提供6个 月的保护。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含利塞膦酸锌铝的佐剂，其中，锌∶利塞膦酸摩尔浓度比在1∶1至16∶1的范围内(例如，2∶1至16∶1的范围内)；并且，锌∶铝摩尔浓度比在1∶1至50∶1的范围内(例如5∶1至50∶1的范围内)；优选地，所述佐剂以颗粒形式存在；优选地，所述颗粒的粒径大小为0.01
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100μm，例如0.01
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60μm，0.01
‑
50μm，0.1
‑
60μm，0.1
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30μm，0.4
‑
30μm，0.4
‑
20μm；优选地，所述佐剂锌∶利塞膦酸摩尔浓度比在1∶1至2∶1，2∶1至4∶1，4∶1至6∶1，6∶1至8∶1，8∶1至10∶1，10∶1至12∶1，12∶1至14∶1，或者14∶1至16∶1的范围内；优选地，所述佐剂锌∶利塞膦酸摩尔浓度比为4∶1或4.5∶1；优选地，所述佐剂锌∶铝摩尔浓度比在1∶1至2∶1，2∶1至3∶1，3∶1至4∶1，4∶1至5∶1，5∶1至6∶1，6∶1至8∶1，8∶1至10∶1，10∶1至12∶1，12∶1至15∶1，15∶1至20∶1，20∶1至30∶1，30∶1至40∶1，或者40∶1至50∶1的范围内；优选地，所述佐剂锌∶铝摩尔浓度比为10∶1；优选地，所述佐剂锌∶利塞膦酸摩尔浓度比在2∶1至8∶1的范围内，例如2∶1至4∶1，4∶1至6∶1，或6∶1至8∶1，并且，锌∶铝摩尔浓度比在2∶1至50∶1的范围内(例如5∶1至20∶1的范围内)，例如2∶1至3∶1，3∶1至4∶1，4∶1至5∶1，5∶1至6∶1，6∶1至8∶1，8∶1至10∶1，10∶1至12∶1，12∶1至15∶1，或15∶1至20∶1；优选地，所述佐剂锌∶利塞膦酸摩尔浓度比为4∶1，并且，锌∶铝摩尔浓度比为10∶1；优选地，所述佐剂锌∶利塞膦酸摩尔浓度比为4.5∶1，并且，锌∶铝摩尔浓度比为10∶1；优选地，所述佐剂pH为5.0
‑
8.0，例如5.0
‑
7.0，5.0
‑
5.5，5.5
‑
6.0，6.0
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6.5，6.5
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7.0，7.0
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7.5，或7.5
‑
8.0；优选地，所述佐剂零电荷点为3.0
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8.0，例如4.0
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8.0，3.0
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4.0，4.0
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5.0，5.0
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6.0，6.0
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7.0，或7.0
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8.0；优选地，所述佐剂对免疫原(例如蛋白)的吸附率为至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％。2.制备权利要求1所述的佐剂的方法，其包括如下步骤：1)提供含有锌离子、铝离子的可溶性盐溶液；2)将步骤(1)中的可溶性盐溶液与利塞膦酸碱溶液混合，从而获得所述佐剂；优选地，所述方法还包括，将步骤(2)获得的佐剂进行灭菌的步骤；优选地，通过过滤灭菌或高温高压灭菌来对所述佐剂进行灭菌，例如通过在121℃下灭菌至少15分钟(例如至少30分钟，例如30
‑
60分钟)，对所述佐剂进行灭菌；优选地，在所述可溶性盐溶液中，锌∶铝的摩尔浓度比在1∶1至50∶1的范围内(例如5∶1至50∶1的范围内)；优选地，在所述可溶性盐溶液中，锌∶铝摩尔浓度比在1∶1至2∶1，2∶1至3∶1，3∶1至4∶1，4∶1至5∶1，5∶1至6∶1，6∶1至8∶1，8∶1至10∶1，10∶1至12∶1，12∶1至15∶1，15∶1至20∶1，20∶1至30∶1，30∶1至40∶1，或者40∶1至50∶1的范围内；优选地，在步骤(2)中，以在1∶1至16∶1的范围内(例如2∶1至16∶1的范围内)的锌∶利塞膦酸摩尔浓度比，将所述可溶性盐溶液与利塞膦酸碱溶液混合；优选地，所述锌∶利塞膦酸摩尔浓度比在1∶1至2∶1，2∶1至4∶1，4∶1至6∶1，6∶1至8∶1，8∶1至10∶1，10∶1至12∶1，12∶1至14∶1或者14∶1至16∶1的范围内；优选地，在步骤(2)中，以使锌离子、铝离子和利塞膦酸共同沉淀的方式，将所述可溶性盐溶液与利塞膦酸碱溶液混合；
所述方法为以共同沉淀的方式使锌离子、铝离子和利塞膦酸产生沉淀，从而获得利塞膦酸锌铝颗粒；优选地，在步骤(2)中，将利塞膦酸碱溶液逐滴加入所述可溶性盐溶液，使锌离子、铝离子和利塞膦酸共同沉淀；优选地，所述利塞膦酸碱溶液选自利塞膦酸氢氧化钠，利塞膦酸磷酸盐溶液(例如利塞膦酸磷酸氢二钠溶液，利塞膦酸磷酸氢钠溶液)，或其任何组合；优选地，步骤(1)所述可溶性盐溶液选自例如硫酸盐溶液、氯酸盐溶液、醋酸盐溶液、或其任何组合，优选氯酸盐溶液或醋酸盐溶液。3.一种免疫原性组合物，其包含免疫原和权利要求1所述的佐剂；优选地，所述免疫原选自蛋白，核酸，多糖，或其免疫原性部分；优选地，所述免疫原来源于病毒、细菌、真菌等病原体；优选地，所述免疫原是蛋白或其免疫原性片段；优选地，所述免疫原是来源于病毒、细菌、真菌等病原体的蛋白或其免疫原性片段；优选地，所述病毒选自，呼吸道病毒(例如，流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒)，肠道病毒(例如BV71病毒，轮状病毒)，水痘带状疱疹病毒(VZV)；优选地，所述免疫原是冠状病毒的蛋白或其免疫原性片段，例如冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)或其免疫原性片段；优选地，所述冠状病毒选自正冠状病毒亚科α属病毒(例如229E和NL63)，正冠状病毒亚科β属病毒(例如OC43和HKU1)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS
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CoV)，和新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)；优选地，所述冠状病毒选自严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS
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CoV)和新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)，优选为新型冠状病毒(SARS

【专利技术属性】
技术研发人员：赵勤俭，黄小芬，聂梅凤，张志刚，袁权，张天英，李少伟，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：