经改造的人免疫缺陷病毒膜蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种经过崭新设计的HIV

【技术实现步骤摘要】
J.P.Moore.Native
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like Env trimers as a platform for HIV
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1 vaccine design.Immunol Rev,2017.)。BG505 SOSIP、NFL2P、UFO等设计皆是在gp140基础上进行的，通过在gp120、gp41胞外区间引入二硫键，在gp41上引入稳定突变I559P或将gp120和gp41之间的furin酶切位点用linker取代等方式增强亚基间的相互作用和三聚体的稳定性，这些设计能够有效地暴露Nab表位而不暴露非中和表位，被认为较好地模拟了病毒上的天然三聚体构象。该类抗原及其通过纳米技术制备的病毒样颗粒抗原相继被运用于动物实验，被证实仅能诱导出针对同型病毒的中和抗体,广谱性有限。因此，HIV
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1免疫原设计仍需另辟蹊径。
[0004]经改造后的gp140的各项理化性质皆得到优化。以BG505
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SOSIP为例，其三聚体含量明显提升，热稳定性较单体gp120提高约14℃，与多种bNab的结合能力得到保留，而与CD4i等一些非中和表位抗体的结合却非常弱(Sanders,Derking et al.A next
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generation cleaved,soluble HIV
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1 Env trimer,BG505 SOSIP.664 gp140,expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non
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neutralizing antibodies,2013.)。以BG505
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SOSIP三聚体免疫小鼠，虽能诱导更强的IgG、Tfh及GC应答，但却无法诱导产生Tier2中和抗体，表位图谱分析表明诱导产生的抗体多针对三聚体base区(Hu,Crampton et al.2015,Murine Antibody Responses to Cleaved Soluble HIV
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1 Envelope Trimers Are Highly Restricted in Specificity,2015.)，这一区域少糖基掩盖，但不存在于天然病毒表面。这一结果提示我们，进行Env三聚体免疫原设计，尽可能减少非中和抗体的暴露，稳定三聚体构象，将进一步推进HIV
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1疫苗研究，但Env三聚体作为疫苗候选分子仍具有一定的局限性，如难以诱导Tier2中和应答，难以诱导产生多毒株交叉中和效应。
[0005]灭活或减毒病毒是许多疫苗的主要有效成分，但截至目前艾滋病尚无有效疫苗及根治措施，灭活或减毒病毒含有病毒上所有的抗原组分，并能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，诱发强的细胞毒性T淋巴细胞应答(CTL)，且SIV减毒活疫苗被证实能成功地保护恒河猴感染SIV病毒(Protection by Live,Attenuated Simian Immunodefificiency Virus against Heterologous Challenge.Journal of Virology,1999.)。但由于HIV
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1的致病性和不可治愈性，减毒或灭活HIV
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1疫苗有潜在感染人体的危险，限制了HIV
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1灭活或减毒病毒在艾滋病疫苗研发中的应用，获得一种经改造完全丧失了致病性且不能通过回复突变重获感染能力的HIV
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1病毒颗粒,制备无潜在感染风险的HIV
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1病毒疫苗是一种十分新颖且安全的疫苗设计思路，有望对艾滋病疫苗研发领域带来突破性的进展。

技术实现思路

[0006]经改造的gp140/gp160蛋白及三聚体
[0007]在第一方面，本专利技术提供了一种重组蛋白，其包含gp120和gp41胞外结构域(gp41 ectodomain,gp41ECTO)，其中，所述gp120位于所述gp41ECTO的β27和α8之间。在某些实施方案中，本专利技术的重组蛋白是经改造的gp140蛋白。
[0008]在本文中，表述“gp120位于所述gp41ECTO的β27和α8之间”是指，gp120在本专利技术的重组蛋白中的位置是介于gp41ECTO的β27和α8之间，而并不旨在限定其被放入β27和α8之间的具体方式。例如，gp120可以直接插入在gp41ECTO的β27和α8之间的相邻氨基酸之间，或者
gp120可以替换gp41ECTO的β27和α8之间的一个或多个连续氨基酸。此外，gp120可以是天然的或经修饰的，gp41ECTO可以是天然的或经修饰的。容易理解，在本专利技术的技术方案中描述gp41ECTO是天然的，是指除了在β27和α8之间包含gp120之外，该gp41ECTO不包含其他人为修饰。在本文中，术语“修饰”优选地是指一个或多个氨基酸残基的缺失、添加或替换。
[0009]在某些实施方案中，所述重组蛋白从N端至C端方向包含：gp41ECTO的α6、α7、β27；gp120；gp41ECTO的α8、α9。
[0010]在某些实施方案中，所述gp41ECTO的β27和α8之间的连接区域中的一个或多个(例如，1
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12个，5
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12个，5
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10个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，或12个)连续氨基酸被替换为gp120。在某些实施方案中，所述连接区域对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置607
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618。
[0011]在某些实施方案中，所述gp41ECTO在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置610
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616的区域中的一个或多个(例如，1
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7个，例如5
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7个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，或7个)连续氨基酸被替换为gp120。
[0012]在某些示例性实施方案中，所述gp41ECTO在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置610
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616的区域的7个连续氨基酸被替换为gp120。在某些实施方案中，所述gp41ECTO的β27和α8之间的连接区域被截去SEQ ID NO:26所示的序列(WNSSWSN)或其对应位置的氨基酸序列。表述“对应位置的氨基酸序列”是指，当不同毒株的gp160序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，与WNSSWSN处于等同位置的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述gp120位于对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置606和619之间。
[0013]在某些实施方案中，所述gp120插入在gp41ECTO的β27和α8之间的连接区域中的相邻氨基酸之间。在某些实施方案中，所述连接区域对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置607
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618本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组蛋白，其包含gp120和gp41胞外结构域(gp41 ectodomain,gp41ECTO)，其中，所述gp120位于所述gp41ECTO的β27和α8之间；优选地，所述重组蛋白从N端至C端方向包含：gp41ECTO的α6、α7、β27；gp120；gp41ECTO的α8、α9。2.权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述gp41ECTO的β27和α8之间的连接区域中的一个或多个(例如，1
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12个，5
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12个，5
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10个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，或12个)连续氨基酸被替换为gp120；优选地，所述连接区域对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置607
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618。3.权利要求2所述的重组蛋白，其中，所述gp41ECTO在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置610
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616的区域中的一个或多个(例如，1
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7个，例如5
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7个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，或7个)连续氨基酸被替换为gp120；优选地，所述gp120位于对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置606和619之间。4.权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述gp120插入在gp41ECTO的β27和α8之间的连接区域中的相邻氨基酸之间；优选地，所述连接区域对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置607
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618；优选地，所述gp120位于对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置609和610之间；优选地，所述gp120位于对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置616和617之间。5.权利要求1
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4任一项所述的重组蛋白，其中，所述gp120是经修饰的gp120，其与天然gp120相比，弗林蛋白酶识别位点包含突变以防止弗林蛋白酶位点被切割；优选地，所述突变选自氨基酸的置换、插入或缺失；优选地，所述弗林蛋白酶位点对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置508
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511；优选地，与天然gp120相比，所述经修饰的gp120中的弗林蛋白酶识别位点被删除。6.权利要求1
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4任一项所述的重组蛋白，其中，所述gp120是经修饰的gp120，其与天然gp120相比，C端截短了1
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11个(例如4
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11个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，或11个)氨基酸；优选地，所述经修饰的gp120在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置501
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511的区域中包含一个或多个(例如，1
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11个，4
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11个；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，或11个)连续氨基酸的缺失；优选地，所述经修饰的gp120在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置501
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511的区域被删除。7.权利要求1
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6任一项所述的重组蛋白，其中，所述重组蛋白的gp120和gp41ECTO之间包含二硫键；优选地，所述重组蛋白在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置37和605之间具有二硫键；优选地，所述重组蛋白在对应于分离株HXB2的gp160序列的氨基酸位置37和605上的氨基酸残基为Cys。8.权利要求1
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4任一项所述的重组蛋白，其中，所述gp120是天然gp120。9.权利要求1
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8任一项所述的重组蛋白，其中，所述gp120的N端和/或C端任选地通过肽接头与所述gp41ECTO连接；
优选地，所述肽接头是(GmS)n，其中m选自1
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4的整数，n选自1
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3的整数。10.权利要求1
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9任一项所述的重组蛋白，其还具备以下特征中的一项或多项：(1)所述gp41ECTO包含下列氨基酸置换：I559P；(2)所述gp120包含下列氨基酸置换：T332N；(3)所述gp120包含下列氨基酸置换：E64K和H66R；(4)所述gp120包含下列氨基酸置换：A316W；(5)所述gp120的CD4bs表位附近的N
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连接糖基化位点(PNGS)被置换以防止糖基化；优选地，所述PNGS选自N276、N301、N360、N463；(6)所述gp120包含内部二硫键；优选地，所述gp120包含I201C和A433C之间的内部二硫键；(7)所述gp120和gp41ECTO之间还包含二硫键；例如，所述重组蛋白在E49C和L555C之间具有二硫键；以上位置的编号是根据HIV
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1分离株HXB2的gp160中的编号。11.权利要求1
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10任一项所述的重组蛋白，其中，所述gp41ECTO和gp120来自相同或不同的HIV
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1毒株；优选地，所述gp41ECTO和gp120来自相同的HIV
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1毒株。12.权利要求1
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11任一项所述的重组蛋白，其包含选自下列的氨基酸序列：(1)由SEQ ID NO:1所示序列的第40位至第651位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(2)由SEQ ID NO:2所示序列的第40位至第652位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(3)由SEQ ID NO:3所示序列的第40位至第651位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(4)由SEQ ID NO:4所示序列的第40位至第652位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(5)由SEQ ID NO:5所示序列的第40位至第665位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(6)由SEQ ID NO:6所示序列的第40位至第678位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(7)由SEQ ID NO:7所示序列的第40位至第661位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(8)由SEQ ID NO:8所示序列的第40位至第666位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(9)由SEQ ID NO:9所示序列的第40位至第671位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(10)由SEQ ID NO:10所示序列的第40位至第676位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(11)由SEQ ID NO:11所示序列的第36位至第607位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(12)由SEQ ID NO:12所示序列的第36位至第646位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(13)由SEQ ID NO:13所示序列的第36位至第648位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(14)由SEQ ID NO:14所示序列的第36位至第638位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(15)由SEQ ID NO:15所示序列的第36位至第639位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(16)由SEQ ID NO:16所示序列的第36位至第836位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(17)由SEQ ID NO:30所示序列的第36位至第673位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(18)由SEQ ID NO:31所示序列的第36位至第678位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(19)由SEQ ID NO:32所示序列的第36位至第683位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(20)由SEQ ID NO:33所示序列的第36位至第678位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(21)由SEQ ID NO:34所示序列的第36位至第688位氨基酸残基构成的氨基酸序列；(22)由SEQ ID NO:3...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾颖，邓婷婷，张慧，黄芳，陈格格，林燕玲，李少伟，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：