一种抗体检测试剂盒(OmpC-IgA)制造技术

本发明专利技术涉及一种检测大肠杆菌外膜孔道蛋白C(OmpC)的IgA抗体的检测检测试剂盒及其检测方法，属于免疫分析检测领域。本发明专利技术所提供的OmpC抗体试剂盒包括OmpC包被的微孔板、酶标记的抗人IgA抗体。本发明专利技术的检测试剂具有高准确性、高特异性和高灵敏度等特点，可用于检测人体组织抗OmpC?IgA抗体，在某些自体免疫性疾病诊断中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析检测领域。具体而言，本专利技术涉及一种检测抗大肠杆菌外膜孔道蛋白C IgA抗体的免疫分析检测试剂盒。
技术介绍
大肠杆菌是人体肠道内的正常细菌之一，一般情况下不致病。但在某些特殊情况下，当机体对大肠杆菌的某种蛋白过激反应时，可发生腹痛、腹泻等肠炎症状。研究表明，一种病因复杂的非特异性炎症性肠病((Inflammatory Bowel Disease, IBD)与机体对大肠杆菌外膜孔道蛋白C的过激反应有关，大约有50%的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗体比正常人高2倍以上，因此，通过检测血清中抗OmpC的IgA可以辅助诊断IBD。现有检测OmpC抗原的双抗夹心法酶联免疫试剂盒，但没有检测OmpC抗体的酶联免疫检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方便、灵敏、准确的检测OmpC抗体的免疫分析检测试剂盒，具体来说是检测人抗大肠杆菌OmpC-1gA抗体的免疫分析检测试剂盒。本专利技术提供了一种检测OmpC-1gA抗体的免疫分析检测试剂盒，该试剂盒包括:包被有OmpC的微孔板、酶标记抗人I gA抗体、阴性对照品、阳性对照品、显色剂、洗涤液。其中包被微孔板的OmpC是用重组的蛋白或者从大肠杆菌纯化所得的蛋白。所述的酶标记抗人IgA抗体采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为戊二醛法。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。所述的洗涤液为0.05% -0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1:1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的样品稀释液为含0.1%吐温-20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液，所述的抗体稀释也为含0.1 %吐温-20的磷酸盐或碳酸盐缓冲液。本专利技术的另一方面，提供了一种检测血清中抗OmpC-1gA含量的方法，包括步骤:(I)用权利要求1-8任一所述的试剂盒进行检测，向OmpC包被的酶标板孔中加入对照品或待测样品溶液，再加入酶标记的抗人IgA抗体，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止液，用酶标仪或化学发光仪测定吸光度值；(2)分析检测结果。本专利技术试剂盒的检测原理为:将OmpC包被在固相载体上，加入待检测样品或对照品，样品或对照品中的抗OmpC抗体就跟固相载体上的OmpC蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，用洗涤液去除无关的成分，然后加入酶标记的抗人IgA抗体，酶标抗体与微孔板上的抗原-抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中含抗OmpC-1gA抗体的量呈正相关，与阴性对照品和阳性对照品检测所得的值进行比较即可得出样品中是否含有抗OmpC-1gA抗体，以及抗体的含量多少。具体实施例方式提供下述实施例是为了更好地理解本专利技术，而不是对本专利技术的内容和保护范围构成任何限制。实施例1大肠杆菌OmpC制备试剂及仪器I)试剂大肠杆菌宿主菌DH5 a、BL21 (DE3)，克隆载体pCR2.lT-vector，表达质粒pET28a (+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶BamHI,Hind III 和 EcoR 1.BamH I, DL2000DNA Marker、T4DNA 连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等2)仪器普通摇床SCS-24 ;隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge 5810R、台式离心机MiniSpin ;高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。3)实验方法载体构建设计引物ATTG GATC CGCT CCGAAAGA 和 TCTC GAGT TAAG CCTG CGGCT 从模板 DNA中PCR扩增出OmpC片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoR 1.BamH I，同时载体上有6XHIS标签，便于后续的蛋白纯化。表达将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1: 1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37°C过夜培养至0D600值约为0.4-0.6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为lmmol/L，非诱导对照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE方法对表达产物进行鉴定。纯化将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，经测定纯化后的蛋白浓度为403mg/L。实施例2酶标抗人IgA抗体制备辣根过氧化物酶标记抗抗体:将抗人IgA抗体与辣根过氧化物酶通过戊二醛法进行偶联得到酶标记抗人IgA抗体。方法是将IOmgHRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH6.80.mo I/LPBS 中，将IOmg HRP溶于0.2mol/LpH5.6醋酸盐缓冲液Iml中，溶解混匀，后加入0.1mol/L Na104溶液1ml，混匀，置冰箱20min，取出加入0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml,室温放置30min后,加入含5mg抗人IgA抗体的水溶液(或PBS) Iml,混勻并装透析袋，以0.05mol/L、pH值9.6碳酸钠缓冲液缓慢搅拌透析6h (或过夜)使之结合，然后取出加NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2ml，置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min，离心，取上清，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH值7.4PBS中，并对之透析过夜。次日再离心除去不溶物，即得酶抗体结合物。用002mol/L、pH值7.4PBS加至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。加60%甘油PBS，分装保存备用。实施例3微孔板包被包被缓冲液:pH9.60.5mol/L的碳酸氢钠缓冲液封闭液:I % BSA (牛血清白蛋白)的PBS溶液用包被缓冲液将OmpC稀释，每孔加入100ul，37°C温育2h或4°C过夜；倾去包被液，用洗涤液洗涤5次，每次Imin ;拍干，然后在每孔中加入200ul封闭液，37°C温育2h ;倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例4免疫分析检测方法建立4.1确定最佳酶标抗人IgA抗体反应浓度(I)用100ng/ml人IgA进行包被，洗涤(2)将酶标抗人IgA抗体用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温，洗漆。(3)加底物显色。加酸终止反应后，在酶标仪读取吸光度(450nm)。取OD值为1.0时的酶标抗人IgA抗体的工作浓度为最佳浓度。试验数据列于表1.表I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测大肠杆菌OmpC?IgA抗体的检测试剂盒，其中包括：包被有OmpC的微孔板、酶标记抗人IgA抗体、阴性对照品、阳性对照品、底物显色剂、洗涤液、反应终止液、样品稀释液。

【技术特征摘要】
1.种检测大肠杆菌OmpC IgA抗体的检测试剂盒,其中包括:包被有OmpC的微孔板、酶标记抗人IgA抗体、阴性对照品、阳性对照品、底物显色剂、洗涤液、反应终止液、样品稀释液。2.据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述OmpC是从大肠杆菌纯化，或通过基因工程方法获得的重组蛋白。3.据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标记抗人IgA抗体所用的酶为辣根过氧化物酶。4.据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照品是OmpC-1gA阴性人血清经56°C I小时灭活，除菌过滤所得。5.据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品是OmpC-1gA阳性人血清经56°C I小时灭活，除菌过滤，用10% (v/v)胎牛血清、0.1% (v/v)Proclin300,pH7.5的磷酸盐缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凡，唐太清，陈菲，霍如松，
申请(专利权)人：苏州和锐医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：