植物体外泛素蛋白降解系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种植物体外泛素蛋白降解系统及其应用。本发明专利技术所提供的植物体外泛素蛋白降解系统为由来自于拟南芥的1种泛素激活酶、14种泛素结合酶、野生型及K48R和K63R点突变的泛素蛋白组成的组合物。与目前常用的体外泛素化反应成分相比，本发明专利技术组合物的全部组分均来源于模式植物拟南芥，当用于检测植物来源的待测蛋白是否具有泛素化活性时，分析结果更真实可信；另外本发明专利技术组合物中包含了能代表拟南芥泛素结合酶绝大部分亚家族特征的组分，覆盖面广，利用这些组分能更全面的检测泛素连接酶的活性并分析E2-E3的特异性结合情况，可为基因功能的研究提供更多的线索；再则，利用点突变泛素蛋白还可分析泛素化反应所形成的多聚泛素链的类型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物体外泛素蛋白降解系统及其应用，特别涉及一种全部活性组分均来自于拟南芥的植物体外泛素蛋白降解系统及其应用。
技术介绍
真核生物体内的泛素/26S蛋白酶体系统(ubiquitin/26S proteasome systemUPS)不仅能降解异常蛋白质，而且能够去除绝大部分半衰期很短的调节蛋白质(如转录因子、细胞周期蛋白等)，因此在维持细胞正常生命活动中起着重要的调控作用。已有的研究证实，该系统在植物中的影响更为重要，其功能几乎涉及到植物中所有生理途径关键步骤的控制，是植物中最精细的调控体系之一。将泛素作为蛋白标签共价连接到靶蛋白分子上需要泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的依次作用。底物上的泛素化修饰有多种类型，如单泛素化、K48-连接的多聚泛素化、K63-连接的多聚泛素化等，泛素化修饰的类型决定了底物蛋白的命运。模式植物拟南芥基因组中共有2个E1、37个E2及超过1400个E3基因。泛素化修饰的底物特异性主要由E3决定，而E2是底物上多聚泛素链结构类型的关键决定因子。37个E2分属于12个亚家族，研究表明在生物体内存在着大量的E2-E3特异性地协同作用。对于某种预测为泛素连接酶或者被泛素化修饰的底物蛋白的未知蛋白来说，利用体外泛素化系统来进行其泛素化活性的分析，是不可或缺的研究内容，实验结果可以为后续研究提供重要的线索。但对于植物基因编码的待测蛋白来说，目前常用的体外泛素化反应体系存在如下缺点:(I)所用的泛素激活酶、泛素结合酶(针对于泛素连接酶自身泛素化活性的检测中)及泛素蛋白大多并非植物编码的蛋白(如常用酵母泛素激活酶，人的泛素结合酶UBCH5b或UBCH5C，及人的泛素蛋白等)，由于不同物种同源基因的功能有可能不完全相同，因此在这样的反应体系中检测植物基因产物的活性，并不能完全代表植物系统中的真实情况，所以常会产生假阳性或假阴性的结果；(2)所用泛素结合酶种类单一，但实际在体内存在着大量的E2-E3的特异性组合，利用单一的E2并不能检测出所有E3蛋白的活性，因此出现部分假阴性的结果不可避免。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物体外泛素蛋白降解系统及其应用。本专利技术所提供的植物体外泛素蛋白降解系统为如下(A)或(B)中所示的用于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的组合物。(A)所述用于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的组合物由如下(I)- (3)组成:(I)泛素激活酶UBA2和野生型单体泛素蛋白；所述泛素激活酶UBA2的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述野生型单体泛素蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；(2)如下14种泛素结合酶的全部或部分:氨基酸序列如序列表中序列5所示的泛素结合酶UBC27 ;氨基酸序列如序列表中序列7所示的泛素结合酶UBCl ;氨基酸序列如序列表中序列9所示的泛素结合酶UBC2 ;氨基酸序列如序列表中序列11所示的泛素结合酶UBC3 ;氨基酸序列如序列表中序列13所示的泛素结合酶UBClO ;氨基酸序列如序列表中序列15所示的泛素结合酶UBC32 ;氨基酸序列如序列表中序列17所示的泛素结合酶UBC13 ；氨基酸序列如序列表中序列19所示的泛素结合酶UBC4 ;氨基酸序列如序列表中序列21所示的泛素结合酶UBC5 ;氨基酸序列如序列表中序列23所示的泛素结合酶UBC6 ;氨基酸序列如序列表中序列25所示的泛素结合酶UBC35 ;氨基酸序列如序列表中序列27所示的泛素结合酶UBC19 ;氨基酸序列如序列表中序列29所示的泛素结合酶UBC16 ;氨基酸序列如序列表中序列31所示的泛素结合酶UBC22 ；(3)点突变泛素蛋白UbK48R和点突变泛素蛋白UbK63R ；所述点突变泛素蛋白UbK48R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第48位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；所述点突变泛素蛋白UbK63R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第63位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；(B)所述用于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的组合物由(A)中所述(I)和所述(2)组成。本专利技术的再一个目的是提供一种用于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的质粒组。本专利技术所提供的质粒组可为如下(I)或(II):(I)由如下I)-3)组成:I)表达泛素激活酶UBA2的质粒，以及表达野生型单体泛素蛋白的质粒；所述泛素激活酶UBA2的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述野生型单体泛素蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；2)14种质粒中的全部或部分，分别表达如下14种泛素结合酶中一种:氨基酸序列如序列表中序列5所示的泛素结合酶UBC27 ;氨基酸序列如序列表中序列7所示的泛素结合酶UBCl ;氨基酸序列如序列表中序列9所示的泛素结合酶UBC2 ;氨基酸序列如序列表中序列11所示的泛素结合酶UBC3 ;氨基酸序列如序列表中序列13所示的泛素结合酶UBClO ；氨基酸序列如序列表中序列15所示的泛素结合酶UBC32 ;氨基酸序列如序列表中序列17所示的泛素结合酶UBC13 ;氨基酸序列如序列表中序列19所示的泛素结合酶UBC4 ;氨基酸序列如序列表中序列21所示的泛素结合酶UBC5 ;氨基酸序列如序列表中序列23所示的泛素结合酶UBC6 ;氨基酸序列如序列表中序列25所示的泛素结合酶UBC35 ;氨基酸序列如序列表中序列27所示的泛素结合酶UBC19 ;氨基酸序列如序列表中序列29所示的泛素结合酶UBC16 ;氨基酸序列如序列表中序列31所示的泛素结合酶UBC22 ；3)表达点突变泛素蛋白UbK48R的质粒，以及表达点突变泛素蛋白UbK63R的质粒;所述点突变泛素蛋白UbK48R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第48位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；所述点突变泛素蛋白UbK63R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第63位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；(II)由(I)中的所述I)和2)组成。在上述(A)和(I)中，所述检测待测蛋白泛素化修饰活性均具体为如下其一或其二:其一，检测待测蛋白是否具有泛素连接酶活性；其二，检测待测蛋白与所述组合物中的哪一种或几种泛素结合酶结合。在上述(B)和(II)中，所述检测待测蛋白泛素化修饰活性均具体为所述(A)和(I)中的其一、其二或如下其三:其三，检测待测蛋白与所述组合物相互作用所形成的多聚泛素链是否含K48-连接的多聚泛素链或K63-连接的多聚泛素链。上述(I)和(2 )中的各蛋白均来源于拟南芥。(2 )中的所述14种泛素结合酶分属于拟南芥泛素结合酶不同亚家族，能覆盖拟南芥基因组大部分泛素结合酶特征。在本专利技术的实施例中，所述质粒组中，各质粒均为携带有相应蛋白编码基因的原核表达载体，其骨架质粒均为pET28a。在本专利技术中，所述泛素激活酶UBA2的编码基因(At5g06460)具体为序列表中序列2所示的DNA分子；所述野生型单体泛素蛋白的编码基因(At4g02890)具体为序列表中序列4所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC27的编码基因(At5g50870)具体为序列表中序列6所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBCl的编码基因(Atlgl4400)具体为序列表中序列8所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC2的编码基因(At2g02760)本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的组合物，为如下（A）或（B）：（A）由如下（1）?（3）组成：（1）泛素激活酶UBA2和野生型单体泛素蛋白；所述泛素激活酶UBA2的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述野生型单体泛素蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；（2）如下14种泛素结合酶中的全部或部分：氨基酸序列如序列表中序列5所示的泛素结合酶UBC27；氨基酸序列如序列表中序列7所示的泛素结合酶UBC1；氨基酸序列如序列表中序列9所示的泛素结合酶UBC2；氨基酸序列如序列表中序列11所示的泛素结合酶UBC3；氨基酸序列如序列表中序列13所示的泛素结合酶UBC10；氨基酸序列如序列表中序列15所示的泛素结合酶UBC32；氨基酸序列如序列表中序列17所示的泛素结合酶UBC13；氨基酸序列如序列表中序列19所示的泛素结合酶UBC4；氨基酸序列如序列表中序列21所示的泛素结合酶UBC5；氨基酸序列如序列表中序列23所示的泛素结合酶UBC6；氨基酸序列如序列表中序列25所示的泛素结合酶UBC35；氨基酸序列如序列表中序列27所示的泛素结合酶UBC19；氨基酸序列如序列表中序列29所示的泛素结合酶UBC16；氨基酸序列如序列表中序列31所示的泛素结合酶UBC22；（3）点突变泛素蛋白UbK48R和点突变泛素蛋白UbK63R；所述点突变泛素蛋白UbK48R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第48位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；所述点突变泛素蛋白UbK63R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第63位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；（B）由（A）中的所述（1）和所述（2）组成。...

【技术特征摘要】
1.关于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的组合物，为如下(A)或(B): (A)由如下(I)- (3)组成: (1)泛素激活酶UBA2和野生型单体泛素蛋白； 所述泛素激活酶UBA2的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述野生型单体泛素蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示； (2)如下14种泛素结合酶中的全部或部分:氨基酸序列如序列表中序列5所示的泛素结合酶UBC27 ;氨基酸序列如序列表中序列7所示的泛素结合酶UBCl ;氨基酸序列如序列表中序列9所示的泛素结合酶UBC2 ;氨基酸序列如序列表中序列11所示的泛素结合酶UBC3 ;氨基酸序列如序列表中序列13所示的泛素结合酶UBClO ;氨基酸序列如序列表中序列15所示的泛素结合酶UBC32 ;氨基酸序列如序列表中序列17所示的泛素结合酶UBC13 ；氨基酸序列如序列表中序列19所示的泛素结合酶UBC4 ;氨基酸序列如序列表中序列21所示的泛素结合酶UBC5 ;氨基酸序列如序列表中序列23所示的泛素结合酶UBC6 ;氨基酸序列如序列表中序列25所示的泛素结合酶UBC35 ;氨基酸序列如序列表中序列27所示的泛素结合酶UBC19 ;氨基酸序列如序列表中序列29所示的泛素结合酶UBC16 ;氨基酸序列如序列表中序列31所示的泛素结合酶UBC22 ； (3)点突变泛素蛋白UbK48R和点突变泛素蛋白UbK63R； 所述点突变泛素蛋白UbK48R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第48位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；所述点突变泛素蛋白UbK63R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第63位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列； (B)由(A)中的所述(I)和所述(2)组成。2.关于体外检测待测蛋白泛素化修饰活性的质粒组，为如下(I)或(II): (I)由如下I)-3)组成: 1)表达泛素激活酶UBA2的质粒，以及表达野生型单体泛素蛋白的质粒； 所述泛素激活酶UBA2的氨基酸序列如序列表中序列I所示；所述野生型单体泛素蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示； 2)14种质粒中的全部或部分，分别表达如下14种泛素结合酶中一种:氨基酸序列如序列表中序列5所示的泛素结合酶UBC27 ;氨基酸序列如序列表中序列7所示的泛素结合酶UBCl ;氨基酸序列如序列表中序列9所示的泛素结合酶UBC2 ;氨基酸序列如序列表中序列11所示的泛素结合酶UBC3 ;氨基酸序列如序列表中序列13所示的泛素结合酶UBClO ;氨基酸序列如序列表中序列15所示的泛素结合酶UBC32 ;氨基酸序列如序列表中序列17所示的泛素结合酶UBC13 ;氨基酸序列如序列表中序列19所示的泛素结合酶UBC4 ;氨基酸序列如序列表中序列21所示的泛素结合酶UBC5 ;氨基酸序列如序列表中序列23所示的泛素结合酶UBC6 ;氨基酸序列如序列表中序列25所示的泛素结合酶UBC35 ;氨基酸序列如序列表中序列27所示的泛素结合酶UBC19 ;氨基酸序列如序列表中序列29所示的泛素结合酶UBC16 ;氨基酸序列如序列表中序列31所示的泛素结合酶UBC22 ； 3)表达点突变泛素蛋白UbK48R的质粒，以及表达点突变泛素蛋白UbK63R的质粒； 所述点突变泛素蛋白UbK48R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第48位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；所述点突变泛素蛋白UbK63R的氨基酸序列为将序列表中序列3的第63位的赖氨酸替换为精氨酸后所得的序列；(II)由(I)中的所述I)和2)组成。3.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的质粒组，其特征在于:所述泛素激活酶UBA2的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子；所述野生型单体泛素蛋白的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC27的编码基因为序列表中序列6所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBCl的编码基因为序列表中序列8所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC2的编码基因为序列表中序列10所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC3的编码基因为序列表中序列12所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBClO的编码基因为序列表中序列14所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC32的编码基因为序列表中序列16所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC13的编码基因为序列表中序列18所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC4的编码基因为序列表中序列20所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC5的编码基因为序列表中序列22所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC6的编码基因为序列表中序列24所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC35的编码基因为序列表中序列26所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC19的编码基因为序列表中序列28所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC16的编码基因为序列表中序列30所示的DNA分子；所述泛素结合酶UBC22的编码基因为序列表中序列32所示的DNA分子；所述点突变泛素蛋白UbK48R的编码基因为将序列表中序列4的第143位和第144位的A均替换为G后所得的DNA分子；所述点突变泛素蛋白UbK63R的编码基因为将序列表中序列4的第188位的A替换为G后所得的DNA分子。4.有权利要2或3所述质粒组中的任一种或几种质粒的重组菌。5.权利要求1-4中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢旗，赵庆臻，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：