本发明专利技术公开了一种丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用，本发明专利技术首先发现在铝胁迫下RB根中SGF14a基因被显著诱导表达，然后从RB根中克隆得到SGF14a基因的全长序列，并通过Gateway技术构建了植物表达载体pK-35S-SGF14a，经农杆菌介导的叶盘转化法转化野生型烟草，筛选得到能够正确表达SGF14a基因的转基因烟草，最后对获得的转基因烟草进行了耐铝能力分析。实验结果表明在烟草中过量表达外源SGF14a基因能够显著提高烟草的耐铝及耐受酸性土壤能力。本发明专利技术中首次报道SGF14a基因能够参与铝胁迫应答，并且通过Gateway技术构建的植物表达载体pK-35S-SGF14a和获得的转基因烟草能够为进一步研究SGF14a基因的在铝胁迫应答中的功能奠定基础，以及为研究铝胁迫应答机制提供了新的基因资源和基因工程操作手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种丹波黑大豆(简称RB)的14-3-3a基因(5GF7办)的植物表达载体及其在提高植物耐铝能力中的应用，属于植物分子基因工程领域。
技术介绍
14-3-3蛋白最早是在动物脑组织中发现的，根据其在DEAE中的迁移率将其命名为14-3-3蛋白，起初被认识是脑组织中特异性蛋白。最近几十年的研究发现，14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，包括动物、植物和微生物。植物14-3-3蛋白是一个大的基因家族，存在很多不同的亚型。拟南芥中存在12种不同亚型的14-3-3基因，烟草中有12种，水稻中有6种，大豆中存在18种14-3-3基因，其中有16种能够发生转录，并且不同亚型的14_3_3基因表达还存在明显的组织特异性。植物14-3-3蛋白通常以同源或异源二聚体的形式存在，并且能够与磷酸化靶蛋白相互作用，调节一系列生物过程，如代谢、生长、发育和信号传导途径等。植物14-3-3蛋白能够参与多种生物过程的调节。14-3-3蛋白能够参与GA、ΑΒΑ、BR和乙烯等植物激素信号通路来调控植物生长发育过程。植物14-3-3蛋白在调控植物体内营养物质代谢过程中也发挥着重要作用，14-3-3蛋白能够通过调节NR、SPS和GS等代谢酶的活性来调控植物体内碳氮代谢过程。并且14-3-3蛋白也能够调节质膜中的K+泵和H+-ATPase酶的活性来维持细胞内外电化学梯度，来调控植·物体内的物质运输过程。同时，植物14-3-3蛋白通过调节叶片中质膜H+-ATPase的活性，来调控气孔的开闭，从而对渗透胁迫作出响应。植物14-3-3蛋白也能够参与多种胁迫的应答。在逆境胁迫的条件下，植物14-3-3蛋白也能对多种生物和非生物胁迫作出应答，包括盐胁迫、磷缺乏、干旱胁迫、冷胁迫和重金属胁迫等非生物胁迫，以及损伤和病原菌侵染等生物胁迫。用盐和冷处理的水稻愈伤组织和幼苗中整个14-3-3基因家族的表达上调。此外，其他的胁迫包括热、氧化和重金属对水稻OsGFM基因的表达也有不同程度的影响，必和OsGFMg几乎可以被所有的胁迫诱导，水稻经损伤处理48h后能够降低0sGF14e基因的表达。磷饥饿使拟南芥中14-3-3y、m的转录水平下降。长期的钾缺乏导致拟南芥中14_3_3c、j的蛋白表达水平下降，14-3-3 的蛋白表达水平增加。另外，14-3-3蛋白在植物免疫响应中具有重要作用。在Cf9/Avr9介导的宿主免疫应答中10个番茄14_3_3基因中有3个能够被特异性诱导表达。最近研究表明，拟南芥14-3-3蛋白能够与RPW8. 2蛋白相互作用，在R蛋白介导的宿主免疫应答中发挥着重要作用。最近，许多研究者通过基因工程的手段增强或抑制植物14-3-3蛋白的表达来研究其功能。在马铃薯中过量表达14-3-3蛋白能够改变脂类、氨基酸和矿物质的组成，并且提高抗氧化能力提高，而抑制14-3-3蛋白的表达则出现相反的结果。在水稻中过量表达玉米的基因后能够增强水稻的抗旱能力，并且在棉花中过量表达拟南芥的基因后能够使棉花保持“常青”及增强了棉花对干旱胁迫的耐受。通过反义技术抑制拟南芥14-3-3蛋白的表达，促进了叶片中淀粉的积累及增加了植物的生长。全世界大约有50%的可耕地属于酸性土壤，而铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。铝毒早期最明显的症状是抑制根尖细胞生长和细胞分裂，从而抑制根生长，导致根系损伤，影响水分和养分的吸收，限制了植物的生长。近年来许多研究者都致力于植物耐铝机制的研究，目前的研究的结果表明能适应酸性土壤生长的植物有两种耐铝机制外部排斥机制和内部耐受机制。外部排斥机制是根尖对铝的排斥，将铝阻止在细胞外；主要包括铝诱导有机酸分泌、根际PH的升高和细胞壁对铝离子的固定等。内部耐受机制主要是利用有机酸在共质体中螯合铝离子从而赋予植物对铝的耐受能力，减小铝的毒害。因此无论是外部排斥机制还是内部耐受机制都涉及到有机酸的参与，可见有机酸在缓解铝毒方面具有重要的作用。在铝胁迫下，许多铝耐受型的植物能够分泌不同的有机酸，从而抵御铝的毒害。例如，在铝胁迫后，大豆和玉米能够分泌柠檬酸、荞麦能够分泌草酸、铝耐受型小麦能够分泌苹果酸。植物质膜H+-ATPase是细胞膜上含量最丰富的蛋白，是植物生长所必须的，能够参与多种胁迫响应的调节，包括对铝毒和磷缺乏的调节等。并且，质膜H+-ATPase主要是通过调节有机酸的分泌来调控植物对铝胁迫的应答。Shen等(2005)研究表明大豆能够通过增加质膜H+-ATPase基因表达、促进质膜H+-ATPase翻译后磷酸化，最终增强了大豆根尖柠檬酸的分泌，从而赋予了大豆对铝的高度耐受。而多年来的研究结果表明14-3-3蛋白在调节质膜H+-ATPase的活性中发挥着重要作用。质膜H+-ATPase是14_3_3蛋白在质膜上的主要结合祀点，14-3-3蛋白能够通过与质膜H+-ATPase的C末端结合而维持其磷酸化的稳定性并增加其活性。然而目前有关14-3-3蛋白能否参与铝胁迫应答的研究报道非常少，还缺少具体可信的实验数据来确信14-3-3蛋白在铝胁迫应答中的作用。并且关于铝胁迫下14-3-3蛋白能否参与调节质膜H+-ATPase活性的研究还未见报道。本专利技术技术是通过Gateway技术构建植物表达载体PK-35S-515F7办，为研究大豆SGFMa基因在植物耐铝机制中的作用提供了有效的分子基因工程技术工具，方便了利用分子生物学的手段研究大豆办基因的功能。以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转办基因的烟草在提高烟草耐铝能力中的应用，为通过基因工程的方法提高植物耐铝能力奠定了理论基础。同时，本专利技术中所获得的结果能够为我们通过基因工`程手段提高植物耐铝能力提高了更多的基因资源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过Gateway技术构建丹波黑大豆(RB)的#Ha基因{SGF14a)的植物表达载体pK-35S-515F7办，该载体中SGF14a基因在35S组成型启动子的控制下表达，通过农杆菌介导的叶盘转化法将该植物表达载体转入野生型烟草中后，外源SGFMa基因在35S组成型启动子控制下能够准确高效表达，同时获得的转基因烟草的耐铝能力及耐受酸性土壤的能力也明显提高。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供如下的技术方法1、外源515F7办基因的获得 根据GenBank上发表的大豆办)基因全长序列，设计如下特异性引物 SGF14a 上游5’ -AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3> (含 HindIII 酶切位点) SGF14a 下游5，-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3，(含有 XhoI 酶切位点)2、植物表达载体ρΚ-355-5Κ^Μ3的构建 Gateway (通路克隆)技术的LR反应构建目的基因的表达载体时，通过重组过程将外源基因连入植物表达载体PK2GW7. O中，不需要经过复杂的限制性内切酶的酶切和连接酶的连接过程,只需要把入门克隆载体和目的载体的质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的酶就能够完成目的基因表达载体的构建，因此用Gateway技术构建目的基因的表达载体不仅成功几率高，而且可以节省很多时间。因此，本文利用该技术来构建目的基因办的植物表达载体。构建策略如图3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体pK?35S?SGF14a，其特征在于：该载体通过Gateway技术构建，该载体中含有35S组成型启动子和SGF14a基因。
【技术特征摘要】
1.一种丹波黑大豆基因的植物表达载体pK-35S-515F743，其特征在于该载体通过Gateway技术构建，该载体中含有35S组成型启动子和SGFMa基因。2.根据权利要求1所述丹波黑大豆SGFMa基因的植物表达载体pK-35S_51...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽梅，郭传龙，李松，周磊，王琳，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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