新型癌症标记物制造技术

本发明专利技术涉及一种新型癌症标记物。更具体地说，本发明专利技术涉及一种确定在呼吸消化系统内是否发生肿瘤，或者对所述肿瘤进行治疗后受试者是否复发的方法。本方法包括测定选自由CNRIP1、SPG20、FBN1、SNCA和INA所组成的组中一个或多个的基因的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态。本方法还涉及用来测定呼吸消化道中的肿瘤的诊断试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于癌症中基因启动子的超甲基化(hypermethylation)的新型标记物。更具体地说，本专利技术涉及一种测定在呼吸消化系统(aero-digestivesystem)内是否发生肿瘤，或者测定受试者对这种肿瘤进行治疗后是否复发的方法。本专利技术的方法包括测定一个或多个特定基因的启动子区域/序列中CpG位点的甲基化状态。本专利技术还涉及对这种甲基化的基因的使用和用来测定癌症的诊断试剂盒。
技术介绍
在人类癌症中，受损的表观遗传学调节与基因突变同样普遍。这些机理在数量上和质量上发生了会导致选择性生长优势的基因表达变化，而这可能产生癌性转变的结果。在与转录失活有关的基因启动子内的异常超甲基化的CpG岛是癌症中最常见的表观遗传学变化(epigenetic change)。由于疾病的早期测定可能提高大多类型癌症的临床疗效结果，因此，对与癌症有关的异常的基因甲基化的确定反映了具有前景的新型生物标记物。对于呼吸消化系统中的癌症(包括结肠直肠癌)来说，开始的研究已经确定了异常甲基化的DNA在患者血液和粪中的存在。由于对高危腺瘤和低危时期癌瘤进行早期测定的潜在临床效应，已经存在于良性肿瘤中且仅少见于正常粘膜中高频率异常超甲基化的基因可能成为良好的候选诊断生物标记物。然而，通常现有的用于呼吸消化系统癌症的早期标记物的灵敏度和特异性依然很差，并且到目前为止，仅少量的实际被筛选用于甲基化的基因显示了理想较高的灵敏度和特异性。根据马勒等人(Muller et al.)和陈等人(Chen et al.)的报道,在VIM (波形蛋白)和SFRP2中发现了特异性超甲基化，并且最近在来自林德等人(Lind et al)的报道中提出ADAMTS1和CRABPl在结肠直肠肿瘤中具有高频率的癌症特异性超甲基化，而NR3C1的超甲基化频率却要低得多。林德等人还确定了 18种作为结肠直肠癌的潜在标记物的基因。在莫里等人(Mori et al.)的研究中，鉴于MAL的甲基化频率低(对应于仅6%的甲基化(2/34样品))，得出了林德等人所讨论的18种候选基因之一的T细胞分化蛋白MAL可能不是合适的用于呼吸消化道癌症的诊断生物标记物的结论。专利技术人对18种候选基因中的多个进行的进一步的分析也没有产生推动性的结果=NDRGl在所有被分析样品中未被甲基化；NR3C1虽然被甲基化，但是仅发生为非常低的频率，而且在随后的SDHA序列分析中不能证实该基因一致性，从而使其不适于作为癌症发展的标记物。总而言之，不存在有这种启示任何由林德等人所讨论的基因可以对目前的癌症检测技术做出改进。因此需要这样一组基因，其中的各个基因在癌症中被高频率且特异性地超甲基化。更具体地，需要这样一组基因该基因在非侵入技术(例如涉及使用粪便样品的技术)，或在可以用在易于获得的样品材料(例如血液或粘液)上的技术中是有用的。这种基因组可以极大地改进对这些癌症进行早期检测的可能。最终的目标可以为开发对仅少数(例如两种或三种)高频率的基因标记物中的超甲基化作用进行测定的诊断测试。因此，需要确定其他的基因，在这些基因中，启动子区域内的CpG岛在癌症中以高频率被超甲基化。
技术实现思路
本专利技术建立在专利技术人对以下的实现由林德等人确定为潜在标记物的特定基因亚群具有在呼吸消化癌症中以非常高的频率被甲基化的CpG位点。因此，本专利技术的一个目的是提供一组用于癌症(例如呼吸消化系统中的癌症，特别是结肠癌和结肠直肠癌)的诊断标记物。该组标记物解决了用于癌症的大多数已知标记物中甲基化低特异性和低频率的问题。 因此，本专利技术的一方面涉及一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法，该方法包括以下步骤a)测定从所述受试者获得的样品中的至少一个基因内的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，其中，所述基因选自由以下所组成的组中CNRIP1，例如由恩萨姆博(ensembl)(基因组结构注释数据库)基因编号ENSG00000119865、恩垂兹(entrez)(美国国家生物技术信息中心提供的在线资源检索系统)编号25927所确定；SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定；FBNl，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定；SNCA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000145335、entrez 编号 6622 所确定；和INA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。该方法还可以包括以下步骤b)与参照物比较甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态；和c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态高于参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则将所述受试者确定为可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发，如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于所述参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则将所述受试者确定为不太可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发。本专利技术的另一方面涉及一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法，该方法包括以下步骤a)测定来自受试者的样品内的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态b)构建得自健康人群样品的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态的百分位数图；c)基于健康人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态并基于患有癌症人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，构建ROC (受试者操作特性)曲线；d)从ROC曲线中选择所期望的灵敏度和特异性的结合；e)从百分位数图测定相应于所测定的或选择的特异性的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态；和f)如果样品中的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态等于或高于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则预测受试者可能患有癌症，并且如果样品中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则预测受试者不太可能患有癌症。 本专利技术还涉及用来测定癌症的诊断试剂盒，该诊断试剂盒含有一个或多个寡核苷酸引物或一组或多组寡核苷酸引物，它们中的每一个与选自以下的基因的核苷酸序列互补CNRIPl，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定；SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法，该方法包括以下步骤：a）测定从所述受试者获得的样品中的至少一个基因内的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，其中，所述基因选自由以下所组成的组中：CNRIP1，例如由ensembl基因编号ENSG00000119865、entrez编号25927所确定；SPG20，例如由ensembl基因编号ENSG00000133104、entrez编号23111所确定；FBN1，例如由ensembl基因编号ENSG00000166147、entrez编号2200所确定；SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定；和INA，例如由ensembl基因编号ENSG00000148798、entrez编号9118所确定。

【技术特征摘要】
2007.02.21 DK PA200700273;2007.04.24 DK PA20070061.一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法，该方法包括以下步骤 a)测定从所述受试者获得的样品中的至少一个基因内的启动子区域、第一外显子或内含子中核酸序列中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，其中，所述基因选自由以下所组成的组中 CNRIPl，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定； SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定； FBNl，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定； SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定；和 INA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤 b)与参照物比较甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态；和 c)如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态高于参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则将所述受试者确定为可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发，如果甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于所述参照物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则将所述受试者确定为不太可能发生了、正在发生或易于发生癌症、或在癌症治疗后复发。3.一种用来测定受试者是否已经发生、正在发生或易于发生癌症、或者受试者在癌症治疗后是否复发的方法，该方法包括以下步骤 a)测定来自受试者的样品内的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态； b)构建得自健康人群样品的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态的百分位数图； c)基于健康人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态并基于患有癌症人群中测定的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，构建ROC (受试者操作特性)曲线； d)从ROC曲线中选择所期望的灵敏度和特异性的结合； e)从百分位数图测定相应于所测定的或所选择的特异性的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态；和 f)如果样品中的所述至少一种基因的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态等于或高于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则预测受试者可能患有癌症，并且如果样品中的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态低于相应于期望的灵敏度/特异性结合的所述甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，则预测受试者不太可能或没有患有癌症。4.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态得到测定。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述至少一种附加标记物选自由以下所组成的组中CNRIP1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定； SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定；FBN1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定；SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定；和 INA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定；MAL，例如由ensembl基因编号ENSG00000172005所确定。6.根据权利要求4所述的方法，该方法包括测定CNRIP1的甲基化水平、甲基化的CpG 位点的数量或CpG位点的甲基化状态，联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基 化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，所述一种附加标记物选自由以下所组成的 组中SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定；FBN1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定；SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定；和 INA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。7.根据权利要求4所述的方法，该方法包括测定SPG20的甲基化水平、甲基化的CpG位 点的数量或CpG位点的甲基化状态，联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化 的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，所述一种附加标记物选自由以下所组成的组 中CNRIP1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定； FBN1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000166147、entrez 编号 2200 所确定；SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、entrez编号6622所确定；和 INA，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000148798、entrez 编号 9118 所确定。8.根据权利要求4所述的方法，该方法包括测定FBN1的甲基化水平、甲基化的CpG位 点的数量或CpG位点的甲基化状态，联合测定至少一种附加标记物的甲基化水平、甲基化 的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态，所述一种附加标记物选自由以下所组成的组 中CNRIP1，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000119865、entrez 编号 25927 所确定； SPG20，例如由 ensembl 基因编号 ENSG00000133104、entrez 编号 23111 所确定；SNCA，例如由ensembl基因编号ENSG00000145335、en...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗尔夫·I·舍特海姆，朗希尔德·A·洛特，古罗·E·林德，泰耶·C·阿尔奎斯特，
申请(专利权)人：奥斯陆大学医院HF，
类型：发明
国别省市：