多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒技术

本发明专利技术涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。具体地，本发明专利技术提供能够以高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针。所述多态性检测用探针为作为选自P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸的、用于检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效判定方法以及多态性检测用试剂盒。
技术介绍
PIK3CA基因编码PI3激酶，该PI3激酶调节对肿瘤形成起着重要功能的信号通路。已知肿瘤组织中常见PIK3CA基因的突变，其中尤其是G1624A(E542K)突变、G1633A(E545K)突变以及A3140G(H1047R)突变被高频率被发现(例如參见Science. (2004)Apr23 ；304(5670) :554(非专利文献 I)以及 Oncogene. (2005)Febl7 ;24(8) :1477-80 (非专利文献2))。 在上述三处存在突变的情况下，报告了不能获得以西妥昔单抗(其被用作不能切除的大肠癌的治疗药)为代表的抗EGFR抗体药的效果(例如，Cancer Res. (2009) ；69 (5). Marchl，2009(非专利文献 3)、BMC Cancer. (2011)Mar25 ；11 :107 (非专利文献 4))。西妥昔单抗之类的分子靶向药非常昂贵，而且有可能产生间质性肺炎等严重的副作用。因此，在给药前測定与药效相关的基因突变，对能够期待药效的患者选择性施与药剂是极为重要的。这种准确且短时间、低成本、简便地測定基因突变的方法备受期待。目前，作为测定基因的多态性的方法，已知通过PCR法扩增含有突变的区域之后，使荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料的发光的减少量，基于熔解曲线分析结果来分析碱基序列的突变的方法(參见日本专利文献特开2002-119291号公报(专利文献I))。
技术实现思路
专利技术要解決的课题在非专利文献I和非专利文献3中，通过直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是，直接测序法中，在进行PCR之后，必须进行测序反应，通过测序仪进行电泳等，需要工夫和成本。另外，由于要处理扩增产物，因此扩增产物有可能混入下一反应体系中。在非专利文献2中，结合PCR-SSCP (单链构象多态性，Single StrandConformation Polymorphism)法和直接测序法来检测PIK3CA的突变。但是,在PCR-SSCP法中，在进行PCR之后需要对扩增产物进行电泳，需要工夫和成本。另外，由于需要处理扩增产物，扩增产物有可能混入下一反应体系中。在非专利文献4中，使用QIAGEN的试剂盒通过Scorpion ARMS法来检测PIK3CA的突变。但是，Scorpion ARMS法需要购买试剂盒。另外，除试剂盒之外,还需要另外的实时PCR装置，需要成本。而且，对每个突变都需要不同的试剂和反应管，需要工夫和成本。专利文献I中通过使用核酸探针的方法来检测多态性。但是专利文献I中，关于核酸探针的设计，仅给出如下启示将核酸探针设计为末端部用荧光染料标记的淬灭探针在与靶标序列杂交时，末端部分中形成的核酸探针和靶标序列的杂交体的多个碱基对至少形成ー个G和C的对。因此，在专利文献I中记载的方法中，需要使用具有对每个突变型都适当的序列的核酸探针。另外，通过本专利技术者的研究，弄清了在核酸探针的序列中，如果GC含量过高，则淬灭探针不会充分起作用。由于这些现状，人们期待着用于检测PIK3CA基因多态性的进ー步的技术开发。本专利技术的课题在于，提供能够高灵敏度、简便地检测PIK3CA基因的多态性的多态性检测用探针、使用其的多态性检测方法。另外，本专利技术的课题在于，提供使用该多态性检测方法的药效判定方法。而且，本专利技术课题在于，提供使用该多态性检测用探针的多态性检测用试剂盒。用于解决课题的手段本专利技术者获得了如下见解通过基于含有PIK3CA基因的多态性的特定区域来设 计淬灭探针，通过使用淬灭探针进行熔解曲线分析能够检测PIK3CA基因的多态性。本专利技术是基于相关见解而实现的。本专利技术如下所述。〈1> 一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述Pl PlI’的至少ー种荧光标记寡核苷酸，(PD寡核苷酸，其相对于含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(PD寡核苷酸，其与含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P2’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P3’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第164位的碱基的、碱基长为10 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第164位的碱基的、碱基长为10 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第163位的碱基的、碱基长为9 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P6’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155 位 第163位的碱基的、碱基长为9 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述P1～P11’的至少一种荧光标记寡核苷酸，(P1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸，其与含有序列编号1～序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位～第232位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P2’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位～第155位的碱基的、碱基长为17～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P3’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第165位的碱基的、碱基长为11～50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第167位的碱基的、碱基长为13～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第164位的碱基的、碱基长为10～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P6’)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第163位的碱基的、碱基长为9～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P7’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第161位的碱基的、碱基长为7～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P8)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P8’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位～第160位的碱基的、碱基长为6～50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧...

【技术特征摘要】
2011.09.27 JP 2011-211373;2012.09.04 JP 2012-19421.一种多态性检测用探针，其用于检测PIK3CA基因的多态性，所述多态性检测用探针为选自下述Pi Pir的至少一种荧光标记寡核苷酸， (PD寡核苷酸，其相对于含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (ΡΓ )寡核苷酸，其与含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P2)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P2’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P3)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P3’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P4)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P4’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P5)寡核苷酸，其相对于与含有在序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第164位的碱基的、碱基长为10 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，且与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；(P5’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第164位的碱基的、碱基长为10 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P6)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第163位的碱基的、碱基长为9 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P6’ )寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第163位的碱基的、碱基长为9 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第163位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P7)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第161位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P7’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第161位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第161位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P8)寡核苷酸，其相对于和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第160位的碱基的、碱基长为6 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P8’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第160位的碱基的、碱基长为6 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第160位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P9)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位 第155位的碱基的、碱基长为12 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P9’)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第144位 第155位的碱基的、碱基长为12 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第144位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (PlO)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位 第155位的碱基的、碱基长为8 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记； (P10’ )寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第148位 第155位的碱基的、碱基长为8 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第148位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记； (PU)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位 第155位的碱基的、碱基长为5 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记；以及 (Pir )寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第151位 第155位的碱基的、碱基长为5 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第151位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，且该胞嘧啶用荧光染料标记。2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其中，所述多态性检测用探针为选自下述Pl-1 PlI’ -1的至少一种突光标记寡核苷酸， (Pl-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的、碱基的碱基长为7 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号I中的第232位和第241位组成的组的至少一种的多态性； (ΡΓ -D寡核苷酸，其为与含有序列编号I 序列编号3的任一者所示的碱基序列中的第226位 第232位的碱基的、碱基长为7 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第226位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别选自由序列编号I中的第232位和第241位组成的组的至少一种多态性；(P2-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P2’-1)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第139位 第155位的碱基的、碱基长为17 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第139位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P3-1)寡核苷酸，其相对于含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P3’_l)寡核苷酸，其与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第165位的碱基的、碱基长为11 50的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第165位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P4-1)寡核苷酸，其相对于与含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P4’ -1)寡核苷酸，其与和含有序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第167位的碱基的、碱基长为13 50的碱基序列互补的碱基序列的互补链在严格条件下杂交，与第167位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P5-1)寡核苷酸，其相对于和序列编号4或序列编号5所示的碱基序列中的第155位 第164位的碱基的、碱基长为10 50的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与第164位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，该胞嘧啶用荧光染料标记，且识别序列编号4中的第155位的多态性； (P5...

【专利技术属性】
技术研发人员：小森真理子，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：