一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明专利技术首先利用分子生物学技术删除了大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶I基因（aroK）、莽草酸激酶II基因（aroL），以及葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCGlc的基因（ptsG）和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因（ydiB），获得了大肠杆菌突变株CICIMB0013·SA4（△aroK,△aroL,△ptsG,△ydiB）。本发明专利技术还构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroG*，ppsA，tktA的重组表达质粒pTHGAA，然后将重组表达质粒pTHGAA电转入重组菌CICIMB0013·SA4中，获得高效生产莽草酸的重组菌大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）。本发明专利技术的大肠杆菌重组菌能够实现发酵过程中莽草酸的高效累积。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，通过研究和改进莽草酸生产途径的相关基因和节点的影响，实现大肠杆菌细胞过量合成和积累莽草酸。 属于微生物基因工程
技术介绍
莽草酸(Shikimic acid)是一种芳香族化合物，含有三个羟基、一个羧基和一个双键，具有手性异构体结构。不仅是手性药物(如抗病毒药)的原料，同时也是许多生物碱、芳香族氨基酸与吲哚衍生物的合成原料。更重要的是，它是神经氨酸酶抑制剂GS4104 (达菲)的关键原材料，可用于合成预防与治疗禽流感和甲型流感的药物。其理化性质如表I 所示。表I莽草酸的理化性质权利要求1.一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌coin BOO13 (SA4/pTHGAA),该重组菌株染色体DNA中有4个基因被删除，同时有3个基因过量表达；删除的基因为莽草酸激酶I基因arot莽草酸激酶II基因aroZ，葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCele基因和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因；过量表达的基因是3_脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因eiroGt转酮酶A基因认 儿磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因中的Γ3个。2.权利要求1所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤如下(1)利用同源重组原理，以野生型大肠杆菌B0013为出发菌株，依次删除CICMB0013 染色体上aroK, aroL，p tsG和ydiB基因，获得菌株BOO13 SA4 ；(2)利用PCR技术分别扩增来源于CICIMB0013菌株的aro#，tktA和基因片段；(3)将aro以，tktA和基因插入pTH18Kr载体中，构建过量表达这三个基因的表达载体的重组质粒，命名为pTHGAA ；(4)将步骤(3)获得的表达载体pTHGAA导入步骤(I)的B0013SA4菌株中，筛选获得转化子，命名为大肠杆菌BOO13 (SA4/pTHGAA)。3.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于aro# 基因是解除了反馈抑制的突变基因，其突变位点在该基因编码蛋白的第146位氨基酸位点，Asp 146 Asn ;即将该基因编码蛋白中146位的天冬氨酸密码子突变为天冬酰酸。4.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤(3)中过量表达基因所用表达载体是pTH18kr，但不仅限于该载体。5.用权利要求1所述大肠杆菌重组菌株发酵生产莽草酸的方法，其特征在于从LB平板上挑取大肠杆菌B0013 (SA4/pTHGAA)单菌落接种于LB液体培养基中，37 °C培养过夜，然后按4%的接种量接种于发酵培养基中，37°C培养，发酵过程中控制碳源浓度在10 g/L，发酵时间60 h ；发酵培养基组成以 g/ L 计为Na2HPO4 · H2O 13，KH2PO4 3，NaCl 0.5，NH4Cl 0. LMgSO41.2,L-苯丙氨酸0. 7,L-色氨酸0. 35,L-酪氨酸0. 7,朽1檬酸铁铵0. 3,—水合朽1檬酸2.1, 对羟基苯甲酸0. 01，对氨基苯甲酸钾0. 01，2，3-二羟基苯甲酸0. 01，酵母抽提物15，蛋白胨 20，碳源25，以纯净水配制；所使用的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；发酵结束时莽草酸的含量达到 20g/L。全文摘要一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，属于微生物基因工程
本专利技术首先利用分子生物学技术删除了大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶I基因(aroK)、莽草酸激酶II基因(aroL)，以及葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCGlc的基因(ptsG)和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)，获得了大肠杆菌突变株CICIMB0013·SA4(△aroK,△aroL,△ptsG,△ydiB)。本专利技术还构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroG*，ppsA，tktA的重组表达质粒pTHGAA，然后将重组表达质粒pTHGAA电转入重组菌CICIMB0013·SA4中，获得高效生产莽草酸的重组菌大肠杆菌B0013(SA4/pTHGAA)。本专利技术的大肠杆菌重组菌能够实现发酵过程中莽草酸的高效累积。文档编号C12N1/21GK102994439SQ20121053391公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日专利技术者陈献忠, 李明明, 王正祥 申请人:江南大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia?coli）B0013（SA4/pTHGAA），该重组菌株染色体DNA中有4个基因被删除，同时有1~3个基因过量表达；删除的基因为：莽草酸激酶I基因aroK，莽草酸激酶II基因aroL，葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCGlc基因ptsG和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因ydiB；过量表达的基因是：3?脱氧?D?阿拉伯庚酮糖?7?磷酸合成酶基因aroG*，转酮酶A基因tktA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA中的1~3个。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈献忠，李明明，王正祥，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。