本发明专利技术公开了一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其lacI、lpxM发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因，所述减毒类脂A为5条脂肪酸链的单磷酸类脂A结构。本发明专利技术构建的菌株在保持类脂降低了生产成本，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于减毒类脂A的大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，特别是一种无需诱导直接生产减毒类脂A的大肠杆菌。
技术介绍
类脂A可以被宿主细胞表面的Toll样受体4 (Toll Like Receptor 4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL_8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂，非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂，安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫 的效果不够理想。因此，人们致力于开发更加高效安全的疫苗佐剂。MP! ”是由Corixa公司商业化生产的已应用于临床试验的脂质体佐剂，人类临床试验的不良反应频率与铝佐剂一样低，其炎症毒性是LPS的O. 1%。其他医药公司近年来也争相开发减毒的类脂A分子疫苗佐齐U，Avand”公司生产了一种减毒的脂质体佐剂产品LipidA-Purified (699200P)，是5条脂肪酸链(3 ’位无次级脂肪酸链)的单磷酸类脂A结构，其生产方法是从沙门氏菌Salmonel IaMinnesota R595中提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化等过程。该生产方法的缺点在于第一、沙门氏菌是致病菌，操作起来比较困难；第二、该方法涉及到化学处理，步骤繁多，影响产品质量和产量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新型的产减毒类脂A的基因工程菌，其生产过程中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，可用于减毒类脂A的大规模生产。为解决上述技术问题，本专利技术提供的基因工程菌为E. coli W3110 Λ IacI Δ IpxMIacZ: :FnlpxE，其基因组中lacl、IpxM发生缺失突变失活，IacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因。类脂A自细胞内膜内侧开始合成，合成途径比较保守，但在转运到外膜外侧的过程中可以发生多种修饰，以适应外界环境。目前，与类脂A结构修饰有关的基因及类脂A合成相关基因已有报道。利用这些基因，根据类脂A分子的合成及修饰机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂A的结构改造成为5条脂肪酸链单磷酸类脂A结构。具体方法是在野生型大肠杆菌染色体IacZ位点处敲入表达IpxE基因。IpxE来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白质可以水解类脂A分子I位上的磷酸；同时敲除染色体上的IpxM基因，其编码的蛋白质可以在类脂A分子3’位添加十四碳羟基脂肪酸链。为使外源基因在大肠杆菌中组成型表达，敲除染色体上的IacI基因，IacI基因编码Iac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白的阻遏作用。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌生产减毒类脂A的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，减毒类脂A的提取方法为将过夜培养的菌液按初始OD6tltl=O. 02转接到200mL LB液体培养基中，37。C培养至OD6tltl=I时8000rpm离心IOmin收集菌体，ddH20洗漆菌体一次后用Bligh-Dyer —相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0. 8, v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌lh,2000rpm离心20min分相,使用一相体系洗漆细胞碎片2_3次；加入27mL12. 5mM的醋酸钠(PH4. 5)溶液，超声震荡10min，100° C水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer 二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1. 8, v/v/v),2000rpm离心IOmin,取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)将类脂A洗出。类脂A的检测、分析薄层层析(TLC)检测将样品点于Gel 60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色。 ESI/MS分析类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPTQ-TOF MassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。附图说明图1野生型大肠杆菌与基因工程菌类脂A TLC分析1:W3110类脂A样品；2:突变株HW003类脂A样品图2基因工程菌类脂AESI/MS分析A:W3110类脂A样品；B:突变株HW003类脂A样品图3野生型大肠杆菌与基因工程菌脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264. 7产生IL_6的分析具体实施例方式实施例1突变株E. coli W3110 Δ IacI的构建UlacI基因敲除片段的获得采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得IacI基因敲除片段，其两端为IacI基因上下游同源臂、中间为kan片段。IacI基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将IacI基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒 pBlueScript II SK(+)-1acI (U)-pkan-lacl (D)。其中，kan 基因两侧带有 IoxP位点。2、敲除感受态的制备及电转化接种带有Red 重组辅助质粒 pKD46 (Datsenko K A, Wanner B L. One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000，97 (12) :6640-6645)的大肠杆菌 W3110 (ATCC39936)于含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30° C，200rpm过夜培养。按2%接种量转接IOOmL LB液体培养基，30° C，200rpm培养至OD6tltl=O. 2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD6tltl=O. 5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4° C，8000rpm离心IOmin收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用ImL 10%甘油悬浮,每管80 μ L分装至预冷的无菌EP管中。将500_1000ng IacI敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1. 5kv电击5ms, 30° C孵育2h，涂布30 μ g/mL卡那霉素的LB固体平板，30° C培养，挑取转化子于含30 μ g/mL卡那霉素及100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。3、温敏型表达载体pCRE的构建根据NCBI 数据库中 pSH47(Guldener U, Heck S，Fielder T,BeinhauerJ, Hegemann JH. A new effcient gene disruption cassette for repeated use inbudding yeast. Nucleic Acids Res, 1996，24:2519-2524)载体序列，米用化学全合成或PCR方法获得ere基因克隆到pKD46质粒，转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产减毒类脂A的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌lacI、lpxM发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达FnlpxE基因，所述减毒类脂A为5条脂肪酸链的单磷酸类脂A结构。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，韩雅宁，陈久洲，李烨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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