本发明专利技术提供一种可用于植物病害生物防治的云雾龙胆内生菌及其发酵工艺，属于生物农药技术领域。本发明专利技术所述菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)LD-b1，已于2012年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?No.6112。混菌琼脂平板打孔法试验表明，菌株LD-b1可抑制多种植物病害真菌的生长。LD-b1能够显著抑制苹果腐烂病菌对苹果果实的侵蚀；温室盆栽试验中，LD-b1对黄瓜褐斑病菌的防治效果达到81.2％。将LD-b1在种子罐中培养24小时至对数生长期，按5％接种量接入生产罐，控制初始pH?7.5，发酵温度30℃，溶氧5％以上，补料分批发酵68小时，菌量可达1010cfu/mL以上。菌株LD-b1生长快，抗菌谱广，在植物病害生物防治方面具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株防治植物病害的生防菌株，包括其发酵生产工艺及其在植物病害生物防治中的应用，属于生物农药
技术介绍
自1898年Vogl从黑麦草种子中分离出第一株内生菌至今，内生菌的研究已经有100多年的历史。近年来的研究表明，几乎所有植物都存在内生菌，它们生长在植物表皮下的组织中，主要包括细菌、真菌和放线菌等。据Dreyfuss和Chapela估计，至少有数十万种内生菌存活于维管植物细胞内或细胞间隙的特殊环境中。我国的植物资源极其丰富，但由于近年来开荒、放牧、造林、采挖等诸多原因，很多野生植物资源遭受严重破坏。云雾龙胆是龙胆科龙胆属多年生宿根草木植物，主治胃炎、气管炎、尿道炎、天花及痘疹，是龙胆属植物中少数未被系统研究过的珍贵药材，被国家列为重点保护品种。对云雾龙胆内生菌的分离和研发有利于保护濒危植物内生菌，并开发植物病害生物防治新的菌种资源。 植物病害是影响农业生产的主要因素之一，目前的防治以使用化学农药为主，容易诱导病菌产生抗药性；而且化学杀菌剂污染环境，破坏农田中微生物菌群的生态平衡，残留的农药不仅影响农产品质量，而且危害人类健康。植物病害的生物防治方法安全有效，越来越引起人们的关注。但从土壤和植物根际分离筛选到的植物病害生防菌在植物体内定植困难，在与病害菌的竞争中难以占据优势。植物内生细菌占据有利生态位、不易受环境条件影响、容易定植于植物体中，能抗病原菌入侵，在植物病害生物防治中具有显著的优势。芽孢杆菌是常见的内生细菌种类，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，能抑制多种植物病原菌；而且芽孢杆菌具有生长快、营养简单、抗逆性强等优点，非常适合开发成生防菌剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供具有防治植物病害作用的一株短小芽孢杆菌菌株，发酵制备出高效的生防菌剂，能更好地防治农田植物病害，减少化学农药对环境的污染。 本专利技术是从云雾龙胆的茎中分离筛选到一株具有广谱抗植物病害真菌活性的细菌，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，菌株代号为LD-b1。其生物学特征为：革兰氏阳性，菌体细胞大小0.5μm～0.6μm×1.5μm～2.1μm；接触酶、柠檬酸盐利用、酪蛋 白水解、七叶苷水解、V.P为阳性；氧化酶、脲酶、H2S产生、吲哚产生、硝酸盐还原、明胶液化、精氨酸双水解酶、淀粉水解、M.R.为阴性；能够利用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸盐；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。菌株LD-b1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年5月14日，保藏号为CGMCC No.6112。 本专利技术所述生防菌株LD-b1的发酵生产工艺流程为：斜面菌种→摇瓶菌种→种子罐→生产罐→产品。 本专利技术中生防菌株LD-b1发酵生产的详细步骤为： 将保藏菌种划线接种于固体斜面培养基上，培养基配方(g/L)为：蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏0.5，琼脂15，pH7.5；30℃培养36～48h，形成菌苔。 用5mL无菌水将活化菌种从试管斜面上洗下，接入种子培养基中，培养基配方(g/L)为：蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉0.2，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.05，氯化钠0.1，pH7.5；250mL三角瓶装100mL的液体种子培养基，接种后的三角瓶置于旋转式摇床上，150r/min、30℃培养24～30h制成摇瓶种子液。 种子罐的培养基与摇瓶种子的培养基相同，发酵条件为：装液量70％，接种量5％，发酵温度30℃，通气量1∶1，罐压0.2kg/cm2，搅拌转速200～600r/min，溶氧10％以上，发酵时间24小时，菌量可达108cfu/mL。 生产罐的培养基配方(g/L)为：蔗糖25，豆饼粉3，硫酸铵2.5，酵母粉0.2，磷酸氢二铵0.8，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.02，氯化钠0.1，pH7.5；发酵条件为：装液量70％，接种量5％，发酵温度30℃，通气量1∶1，罐压0.2kg/cm2，搅拌转速100～300r/min，溶氧5％以上，发酵30小时和45小时分别补加10g/L蔗糖两次，发酵时间68小时，菌量可达1010cfu/mL。 本专利技术中菌株LD-b1对植物病害真菌的生物防治效果 混菌琼脂平板打孔法的试验表明，菌株LD-b1对黄瓜褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌、茄子枯萎病菌、小麦赤霉病菌、白菜黑斑病菌和番茄灰霉病菌等植物病害真菌的生长均有显著的抑制效果，其中对黄瓜褐斑病菌和苹果腐烂病菌的拮抗作用最强。菌株LD-b1在苹果果实上能够显著地抑制苹果腐烂病菌对果实的侵蚀；温室盆栽试验中，LD-b1对黄瓜褐斑病菌的防治效果达到81.2％。 附图说明图1菌株LD-b1对苹果腐烂病菌生长的拮抗作用。 图2菌株LD-b1对黄瓜褐斑病菌生长的拮抗作用。 图3菌株LD-b1在苹果果实上对苹果腐烂病菌的抑制作用。 图4菌株LD-b1防治黄瓜褐斑病害的盆栽试验。 具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下实施例旨在说明本专利技术而不是对本专利技术的进一步限定。 实施例1 短小芽孢杆菌LD-b1的分离 取新鲜云雾龙胆的一段茎，无菌水冲洗2次，用无菌滤纸吸干水分；在70％乙醇溶液中浸泡2分钟，再用0.1％升汞浸泡30秒，无菌水冲洗3次。在无菌条件下用刀片将外皮削去，并截成1厘米左右的小段，置于筛选培养基表面，30℃培养4～8天。待平板有菌长出后，平板划线纯化，得到分离细菌菌株的纯培养物。 实施例2 菌株LD-b1的形态学特征 LD-b1在固体培养基平板上30℃培养1天，形成乳白色不透明菌落，菌落近似圆形，边缘不整齐，中间有小突起，直径0.6～1.1cm，不分泌色素；菌株LD-b1的菌体细胞为短杆状，大小0.5μ.m～0.6μm×1.5μm～2.1μm，革兰氏阳性，有芽孢。 菌株LD-b1的生理生化特征 菌株LD-b1的生长温度范围为8～50℃，pH范围5.5～8.5，NaCl浓度范围0～7％；能够利用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸盐；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇；菌株LD-b1的接触酶、柠檬酸盐利用、酪蛋白水解、七叶苷水解、V.P为阳性，氧化酶、脲酶、H2S产生、吲哚产生、硝酸盐还原、明胶液化、精氨酸双水解酶、淀粉水解、M.R.为阴性。 菌株LD-b1的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测定 将菌株LD-b1接种于种子培养基，150r/min、30℃摇床培养24小时，离心收集菌体，用0.5mol/LNaCl洗1次，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，用酚-氯仿法提取基因组DNA，用UNIQ-10试剂盒提取细菌基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-GAGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′)和154本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株防治植物病害的云雾龙胆内生菌，为革兰氏阳性的短小芽孢杆菌(Bacillus？pumilus)，菌株代号为LD？b1，该菌株于2012年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.6112。
【技术特征摘要】
1.一株防治植物病害的云雾龙胆内生菌，为革兰氏阳性的短小芽孢杆菌(Bacillus
pumilus)，菌株代号为LD-b1，该菌株于2012年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管
理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6112。
2.防治植物病害的生防剂，包括短小芽孢杆菌LD-b1或从其来源的拮抗活性物质作为有
效成分。
3.权利要求2所述的生防剂，其中植物病害包括黄瓜褐斑病、黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病、
苹果腐烂病、茄子枯萎病、小麦赤霉病、白菜黑斑病和番茄灰霉病。
4.短小芽孢杆菌LD-b1的培养基配方：
种子培养基(g/L)：蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉0.2，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.05，氯
化钠0.1，pH7.5，121℃灭...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄海东，杨红澎，李晓雁，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：
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