磷硫酰化DNA的酶促合成方法技术

本发明专利技术涉及一种生物医药技术领域的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，该方法包括以下步骤：以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。本发明专利技术提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性，可用于分子生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA分子的磷硫酰化修饰,具体涉及一种用于DNA分子磷硫酰化修饰的酶促合成方法。
技术介绍
磷硫酰化修饰的DNA可以抵抗多种DNA水解酶的作用，因此在基因治疗和分子生物学研究，如基因阻断、定点突变等方面具有广泛的应用。目前对DNA进行磷硫酰化修饰需要化学合成的方法实现，但是化学法具有多种局限性，如催化效率不高，只能合成短链并且磷硫酰化DNA是两种旋光异构体的混合物，纯化分离步骤复杂等。而利用酶学方法进行DNA磷硫酰化修饰除了可以解决化学合成中遇到的问题，还具有多方面的优势，如可以对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性。·目前，发现在诸多微生物中存在能够对DNA进行磷硫酰化修饰的基因簇。利用基因克隆、异源表达和蛋白质纯化等技术，完成了利用沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87中的磷硫酰化修饰系统进行体外催化合成磷硫酰化的DNA。该催化体系包括两种方式进行分别利用全细胞裂解液和纯化的负责修饰的蛋白作为催化剂，进行了30bp和4Mb不同长度的DNA的磷硫酰化修饰。利用LC-MS技术检测发现，两种长度的DNA都成功的被磷硫酰化修饰，并且该修饰具有序列特异性和单一的R构型。因此，对不同生物来源的DNA磷硫酰化催化体系的开发，可以合成不同序列特异性和任意长度的磷硫酰化DNA。在此基础上通过微生物发酵或者酶工程的方法进行工业化生产磷硫酰化修饰的DNA分子，用于基因治疗药物、基因疫苗、或者分子生物学研究等领域。现有技术未发现利用酶学方法对DNA进行磷硫酰化修饰的报道。专利技术内容本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种利用生物催化方法对DNA进行磷硫酰化修饰。本专利技术提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性，可用于分子生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，本专利技术涉及一种磷硫酰化DNA的酶促合成方法，该方法包括以下步骤以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。优选地，所述全细胞裂解液的制备包括如下步骤接种沙门氏菌(Salmonellaenterica) serovar Cerro 87至LB培养基中，培养,收集菌体,用磷酸缓冲液洗漆所述菌体，用反应缓冲液重悬，冻融，超声破碎所述菌体，离心，取上清液，即获所述全细胞裂解液。优选地，所述反应缓冲液包括20mM Tris_HCl、60mM KClUOmM MgCl2UmM EDTA,2mM DTTUmM PMSF和体积比为25%的甘油，所述反应缓冲液的pH为8. O。优选地，所述酶促反应包括如下步骤制备短链DNA-链霉亲和素复合体，向所述DNA-链霉亲和素复合体中加入所述全细胞裂解液，再加入终浓度为ImM的ATP、0. ImM的PLP和O. ImM的Cys，常规条件下反应，离心终止反应，用磷酸缓冲液洗涤反应物。 优选地，所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的制备包括如下步骤从沙门氏菌克隆DNA磷硫酰化修饰的酶蛋白基因，构建质粒表达载体，转化宿主细胞，诱导表达，裂解，镍柱亲和纯化，FPLC纯化，蛋白浓缩，即得所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白。进一步优选地，所述沙门氏菌为沙门氏菌(Salmonella enterica) serovarCerro87。优选地，所述酶促反应包括如下步骤取基因组DNA和所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白置于反应缓冲液，并加入终浓度为ImM的ATP、0. ImM的PLP和O. ImM的Cys，30°C下进行反应，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入异丙醇沉淀，洗涤，干燥，即获磷硫酰化修饰的·DNA。优选地，所述反应缓冲液包括20mM的Tris-HCl和IOmM的MgCl2,所述反应缓冲液的pH为8. O。优选地，所述各酶蛋白的重量份相同。优选地，所述DNA的链长为30bp或4Mbp。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果本专利技术提供的用于DNA磷硫酰化修饰的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且能够序列特异性和空间构象特异性地生物催化合成磷硫酰化修饰的DNA，可用于分子生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。本专利技术所提供的酶催化体系，可利用生物信息学方法或者分子生物学方法，从其他微生物中得到同源的DNA磷硫酰化修饰系统。本专利技术所提供的酶催化体系可以通过改变一个或几个蛋白步骤或者引入其他同源蛋白而得到新的序列特异性的磷硫酰化修饰的DNA。本专利技术所提供的酶催化体系可以用来提高磷硫酰化修饰的DNA的产量，例如，利用基因工程等方法提高其中一种或几种酶的活性。 本专利技术所提供的酶催化体系可以通过改变4种DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的比例来降低或提高磷硫酰化修饰的DNA的修饰频率。本专利技术所提供的酶催化体系可以通过改变体外催化条件来改变磷硫酰化修饰的DNA的产量、序列特异性或者修饰频率。这些体外催化条件包括pH，缓冲液成分，金属离子坐寸ο本专利技术所提供的DNA磷硫酰化修饰的方法可以用于各种其他同源的酶催化体系中，从而产生不同类型的磷硫酰化修饰DNA。附图说明图I是体外酶催化合成DNA磷硫酰化修饰反应的示意图；图2是全细胞裂解液催化30bp DM磷硫酰化的LC-MS检测结果图；图3是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，磷硫酰化DNA作为正对照的LC-MS检测结果图；图4是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，酶催化不含磷硫酰化修饰的DNA的LC-MS检测结果图；图5是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，酶催化体系中灭活DptC作为负对照的LC-MS检测结果图。具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的实施例作详细说明以下实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SambiOOk等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所涉及的菌种来源信息如下沙门氏菌(Salmonellaenterica) serovar Cerro 87 来自于文献《TiegangXU et al. A novel host-specific restriction system associated with DNAbackboneS-modif ication in Salmonella. Nucleic Acid Research,2010,38 (20)7133-7141》；大肠杆菌BL21 (DE3) plusS :购买自美国马里兰州盖色斯堡生物制剂公司Gibco-BRL0实施例I、全细胞裂解液法合成磷硫酰化DNA(I)、全细胞裂解液的制备接种沙门氏菌(Salmonellaenterica) serovar Ce本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磷硫酰化DNA的酶促合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以DNA和L？半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：由德林，曹博，邓子新，郑晓青，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：