一种合成利那洛肽的方法技术

本发明专利技术涉及医药合成领域，公开了一种合成利那洛肽的方法。本发明专利技术所述方法固相合成在SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，裂解脱除保护基和树脂固相载体后用GSH/GSSH氧化体系进行氧化反应，得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。本发明专利技术所述方法采用Mmt保护基保护半胱氨酸侧链，用逐一偶联方式合成利那洛肽线性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化体系氧化得到利那洛肽，与现有方法相比，提高了线性粗肽纯度，可不经纯化即可进行下步氧化步骤，且所获得利那洛肽粗品纯度和收率也显著提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药合成领域，具体涉及。
技术介绍
利那洛肽(Linaclotide)是一种新型GC-C (肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂，该化合物为14个氨基酸组成的多肽，通过固相合成技术得到。利那洛肽可激活肠上皮细胞顶端表面的GC-C受体，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸增多。其净效应是氯和碳酸氢盐分泌进入肠腔增加，进而导致液体分泌增多以及大便通过加速，用于治疗成人慢传输型便秘和便秘型肠易激综合征(IBS-C)患者，结构序列为NH2-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-COOH (3 对 二硫键为 1-6、2-10、5-13)。关于利那洛肽的制备方法，国内外均没有专利报道，仅有Miriam等人发表一篇文献尝试了利那洛妝的合成(Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of theCysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online 4 August 2010 in WileyOnline Library)。文献中分别采用了三种方法进行合成(I)采用Trt为Cys保护基固相合成线性粗肽，然后在液相中室温一步氧化得到利那洛肽；(2)分别采用Trt，Acm为Cys保护基固相合成线性粗肽，然后采用半选择性策略完成二硫键的合成；(3)分别采用Mmt，Acm, Trt或Acm, Trt, pMeOBzlm为Cys保护基固相合成线性粗肽,然后采用完全选择性策略完成二硫键的合成。但是，方法2、3使用了多种侧链脱除和氧化试剂，每一个步骤必然带来杂质的增多，因此不利于得到高纯度，高收率的产物，也不利于工艺的放大。方法I虽然过程步骤简单，只使用了一种保护基保护半胱氨酸侧链巯基，但是半胱氨酸侧链保护基的选择是影响利那洛肽合成的关键因素之一，方法I选用的Trt保护基不利于利那洛肽线性粗肽纯度的提高，造成线性粗肽纯度较低，往往需要纯化才能进行利那洛肽3对二硫键的环化，不利于大规模生产。此外，方法I在最后一步的氧化形成利那洛肽粗品过程中，采用GSH (还原性谷胱甘肽)氧化体系进行3对二硫键的环化，但是该氧化体系不能准确定位3对二硫键的位置，极易造成大量杂质的产生，造成利那洛肽粗品纯度较低，不利于后续的纯化和总收率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供，使得本专利技术所述方法能够提高利那洛肽线性粗肽纯度以及利那洛肽粗品纯度和总收率。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案，包括以下步骤步骤I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，所述Cys侧链上偶联的保护基为Mmt保护基；步骤2、利那洛肽树脂裂解脱除所有保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化体系对利那洛肽线性粗肽进行氧化反应，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。其中，所述树脂固相载体优选为王树脂，更优选为替代度为I. Ommol/g的王树脂。GSH/GSSH氧化体系所指为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSH)联合使用的氧化体系。本专利技术采用一步氧化方法制备利那洛肽，避免了不同氧化方法带来的杂质。同时，本专利技术采用Mmt作为Cys的侧链保护基团能够极大的提高线性粗肽的纯度，使线性粗肽不经过纯化直接应用于下一步的氧化过程中。而且，采用GSH/GSSH体系能够极大的降低线性粗肽中的杂质，有利于下一步纯化过程。在本专利技术所述方法中，以利那洛肽线性主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式 NH2-Cysl-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cysi0-Thrll-Gly12-Cys13-Tyr14-C00HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即为上式中多肽序列，本专利技术在步骤I中固相合成的利那洛肽树脂是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基础上，在其N端、、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体。本专利技术所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基、巯基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。对于利那洛肽的合成，其Cys侧链保护基的选择关系着利那洛肽线性粗肽的纯度，保护基随意的选择有可能造成利那洛肽线性粗肽的纯度较低，如文献“Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online 4 August 2010 in Wiley Online Library” 中公开的第一种方法，按照其记载的方法，所得到的利那洛肽线性粗肽的纯度仅为40%左右，可见要提高利那洛肽线性粗肽纯度，需要在深入研究利那洛肽合成的基础上，付出创造性劳动，方可找到合适的Cys侧链保护基。而对于其余需要保护侧链的氨基酸，本专利技术优选通过Trt保护基保护Asn的侧链；通过OtBu保护基保护Glu的侧链；通过tBu保护基保护Tyr、Thr的侧链。作为优选方案，步骤I具体为在活化体系存在下，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu)-0H)与树脂固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr (tBu)-树脂固相载体，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Thr (Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶联有 Fmoc 保护基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶联有Fmoc保护基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)进行延伸偶联，偶联完后脱除Fmoc保护基，得到利那洛肽树脂(H-Cys(Mmt)-Cys本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、固相合成在SEQ？ID？NO:1所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，所述Cys侧链上偶联的保护基为Mmt保护基；步骤2、利那洛肽树脂裂解脱除所有保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化体系对利那洛肽线性粗肽进行氧化反应，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第1位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宓鹏程，潘俊锋，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：