本发明专利技术公开了人类肠道病毒的四色荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、AMV逆转录酶液、TaqDNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，特点是还包括内对照、多重10×PCR反应缓冲液、浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白及浓度均为100μM的各上、下游引物及浓度均为50μM的各特异性探针，其中各上、下游引物、特异性探针序列以及内对照序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12及NO.13所示，优点是检测敏感性高，特异性好、准确快速、无假阳性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中的荧光PCR试剂盒，尤其是涉及用于人类肠道病毒通用检测及肠道病毒EV71型、CoxA16型分型检测的包含内対照的四色荧光RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病韋(enterocytopathic human orphan virus ECHO简称埃可病韋)及新型肠道病韋共71个血清型。而由肠道病毒引起的手足ロ病是ー类急性传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征，本病急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有。引起手足ロ病的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviriade)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的4型、5型、7型、9型等；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)，二者在遗传学上密切相关，常为混合感染和交替感染。我国手足ロ病流行，其病原主要为EV71型和CoxA16型。通常情况下，EV71与CoxA16引起的手足ロ在临床症状上难以区別。肠道病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定、血清学检测和分子生物学技木。病毒的分离培养和血清学方法，繁杂费吋，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学特别是PCR技术，由于其检测材料用量少、快速、灵敏度高且具有很高的特异性，在病毒感染的诊断中发挥越来越重要的作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是先将RNA反转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶在体外快速扩增目的DNA片段的技术。实时荧光RT-PCR技术在普通RT-PCR的基础上，在扩增反应体系中加入ー对或多对特异性PCR引物同时加入相对应的特异性荧光探针，该探针为两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。而在PCR扩增吋，探针同模板上目的扩增片段杂交，由于DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过ー个PCR循环，荧光信号也和目的片段一祥，有ー个同步指数增长的过程。中国为肠道病毒71型核酸检测试剂盒及检测方法(申请号201010105088. 5)公开了ー种肠道病毒71型核酸检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液及肠道病毒71型正向引物和反向引物及特异性的荧光探针；中国为肠道病毒CoxA16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒(申请号200810121454. 9)公开了ー种肠道病毒柯萨奇A16检测试剂盒的上下游引物和特异性探针；中国为肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒(申请号200810121453. 4)公开了ー种肠道病毒的上下游引物和特异性探针。上述检测试剂盒用于检测相应的肠道病毒具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点，但是上述试剂盒都无法在同一反应管中实现肠道病毒的通用检测以及肠道病毒EV71型、CoxAie型的分型检测，同时大量实验数据显示，在粪便、直肠拭子、咽喉拭子样本中，PCR抑制物存在的比例为I. 8% 3. 4%，表明内对照对监控PCR抑制物的存在具有重要作用，而目前现有手足ロ病的体外诊断试剂盒都没有内对照而且存在特异性和灵敏度较低，检测步骤繁琐等缺陷，需要进ー步提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够同时在同一反应管中实现人类肠道病毒的通用检测及EV71亚型、CoxAie亚型分型快速检测的特异性强、灵敏度高、可靠性強、无假阴性结果的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为 I、肠道病毒四色荧光RT-PCR试剂盒(简称试剂盒)，本试剂盒是在对人类肠道病毒核酸 序列分析的基础上，通过生物信息学方法分析选取保守基因序列设计出特异性引物，利用荧光PCR技术对肠道病毒进行检測。在按下述方法设计的引物、探针存在下，在荧光PCR仪中对病毒核酸进行RT-PCR扩增，来实现对肠道病毒的检测。具体的说，本试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、内对照、AMV逆转录酶、Taq聚合酶，其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10X荧光RT-PCR反应缓冲液、EV通用型引物、EV通用型探针、EV71型引物、EV71型探针、CoxA16型引物、CoxA16型探针、内对照引物、内对照探针、牛血清白蛋白；多重IOX荧光RT-PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁，其中各引物及探针的序列如下， 依据肠道病毒EV71型VPl基因保守序列设计引物、探针 EWlPf 上游引物5' -0GCAAATGCGTAGAAAGGT-3'19bp ； EWlPr 下游引物:5' -GGAGCAATTGTGGGACAACT-3'20bp ； EV71Pb 探针5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1-3'28bp ； 依据肠道病毒CoxAie型VPl基因保守序列设计引物、探针 CoxA16Pf 上游弓丨物:5' -GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'22bp ； CoxA16Pr 下游引物:5' -GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'19bp ； CoxA16Pb 探针5' -HEX-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-3'27bp ； 依据肠道病毒EV基因5'非翻译区设计通用引物、探针 EVPf 上游弓丨物:5' HimMTGOGGCrMTOC-3'19bp ； EVPr 下游弓丨物:5' -GATTGTCA0CATMGCAGCCA-3'21bp ； EVPb 探针5, -ROX-MCCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQト3'28bp ； 内对照序列为 5 ' -GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCACACCACACCCACACACGTGTT GGATCAATTT CGAGATGCGA GCTGCCAAGC-3 'IOObp ； 依据内对照序列设计内对照引物、探针ICPf 上游弓丨物:5' ^TGCTCACA(XAGTTGC0GC-3'20bp ； ICPr 下游弓丨物:5' "GCTTGGCAGCTOGCATCTOHB'20bp ；mMfB2p,所述的阳性对照品为连接有设计肠道病毒通用型、EV71型、CoxAie型的引物、探针的基因保守序列的pUCm-T克隆载体。所述的阴性对照品为无RNA酶的DEPC水。所述的内对照为连接有内对照人工设计序列的pUCm-T克隆载体，所述的内对照的浓度为 104copies/ml。所述的多重10 X PCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类肠道病毒四色荧光RT？PCR检测试剂盒，包括多重荧光RT？PCR反应母液、AMV逆转录酶液、Taq？DNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，其特征在于：还包括内对照、所述的多重荧光RT？PCR反应母液包括多重10×PCR反应缓冲液、牛血清白蛋白及各上、下游引物及各特异性探针，其中所述的各上、下游引物序列、所述的特异性探针序列以及内对照序列如下：肠道病毒EV71型上游引物EV71Pf如SEQ？ID？NO.1所示，5′？CGCAAATGCGTAGAAAGGT？3′；肠道病毒EV71型下游引物EV71Pr如SEQ？ID？NO.2所示，5′？GGAGCAATTGTGGGACAACT？3′；肠道病毒EV71型荧光探针EV71Pb如SEQ？ID？NO.3所示，5′？FAM？AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC？BHQ1？？3′；肠道病毒CoxA16型上游引物CoxA16Pf如SEQ？ID？NO.4所示，5′？？GAACCATCACTCCACACAGGAG？3′；肠道病毒CoxA16型下游引物CoxA16Pr如SEQ？ID？NO.5所示，5′？？GTACCTGTGGTGGGCATTG？3′；肠道病毒CoxA16型荧光探针CoxA16Pb如SEQ？ID？NO.6所示，5′？HEX？？CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG？BHQ1？？3′；肠道病毒通用型上游引物EVPf如SEQ？ID？NO.7所示，5′？CCCTGAATGCGGCTAATCC？3′；肠道病毒通用型下游引物EVPr如SEQ？ID？NO.8所示，5′？GATTGTCACCATAAGCAGCCA？3′；肠道病毒通用型荧光探针VPb如SEQ？ID？NO.9所示，5′？ROX？AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC？BHQ1？？3′；内对照序列如SEQ？ID？NO.10所示：5′？GTGCTCACAC？CAGTTGCCGC？GGAAAGTATG？TGGAATGTTA？ACACACCCAC？ACCACACCCA？CACACGTGTT？？？GGATCAATTT？？CGAGATGCGA？？GCTGCCAAGC？3′；内对照上游引物ICPf如SEQ？ID？NO.11所示，5′？？GATTAGTATGTCGGCTGCAGGTA？？3′；内对照下游引物ICPr如SEQ？ID？NO.12所示，5′？？CAAGGCTCATAGCGCGTATC？？3′；内对照荧光探针CPb如SEQ？ID？NO.13所示，5′？CY5？？CCGGTACATCCGACGGAGCGTC–BHQ2？3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙大为，周冬根，倪敏君，岑晨霞，陈丽，翟敏，曹雪春，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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