本发明专利技术公开了一种H1N1亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。该试剂盒包括检测或辅助检测H1亚型和N1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，该成套引物由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-N1和简并引物LB-N1组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。本发明专利技术特异性强、灵敏度高、仪器设备及操作简单、结果便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行H1亚型和H1N1亚型禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及HlNl亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。
技术介绍
禽流感(Avian Influenza，Al)是禽流行性感冒的简称，是由正粘病毒科流感病毒属A型禽流感流行性感冒病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染病。根据A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，禽流感病毒(AIV)可进一步分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚型和9种NA亚型。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒，病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。AIV基因组的分节段特性使得两种或两种以上不同亚型流感病毒共同感染一个细胞时，子代病毒 在装配时其核酸片段可能以同源交换的形式发生基因重排而导致抗原转变，从而产生能引起大流行的新流行株。人类历史上几次大流感的流行毒株(H2N2、H3N2)均是禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排而产生，而HlNl亚型AIV传播给人直接导致了 1918年世界范围内的毁灭性人类大流感流行。当前流行的甲型HlNl流感病毒的部分基因也来源于AIV。因此HlNl亚型AIV为低致病性AIV，但具有重要的公共卫生学意义。加强HlNl亚型AIV的检测和监测，对保障人类健康意义重大，而快速简便特异的检测技术有助于HlNl亚型AIV的早期大规模诊断。目前禽流感病毒常采用的检测方法包括病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术(IFA)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Genechips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplifi cation, LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，通过逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)就可以完成RNA的检测。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。本专利技术所提供的检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-Nl和简并引物LB-Nl组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。所述成套引物中，各简并引物的摩尔比可为1.6レ!1101所述简并引物？1 -!11、I.6 μ mol所述简并引物BIP-H1、0. 2ymol简并引物F3_H1、0. 2 μ mol简并引物B3-H1、0.8 μ mol简并引物LF-H1、0. 8ymol简并引物LB-H1、I. 6 μ mol所述简并引物FIP-N1、1.6 μ mol所述简并引物BIP-N1、0. 2ymol简并引物F3_N1、0. 2 μ mol简并引物B3-N1、0.8 μ mol简并引物LF-Nl和0. 8 μ mol简并引物LB-N1。所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是简并引物中各种单链DNA摩尔数之和。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供ー种检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。本专利技术所提供的检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反转录酶和上述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。所述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，包括ニ套独立包装的试剂，分别为反应试剂A和反应试剂B ;所述反应试剂A含有I. 6 μ mol所述简并引物FIP-Hl、I. 6 μ mol所述简并引物BIP-Hl、0. 2 μ mol所述简并引物F3-H1、0.2 μ mo I所述简并引物B3-H1、0. 8 μ mo I所述简并引物LF-Hl、0. 8 μ mo I所述简并引物LB-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜碱；所述反应试剂B含有I. 6 μ mol所述简并引物FIP-Nl、I. 6 μ mol所述简并引物ΒΙΡ-Ν1、0· 2μπιο1所述简并引物F3-N1、0. 2ymol所述简并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol所述简并引物LF-NUO. 8 μ mol所述简并引物LB-NlUmmol所述dATPUmmoI所述dCTP、lmmol所述dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。所述简并引物的摩尔数均是指简并引物中各种单链DNA的摩尔数之和。所述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段；所述反转录酶可为M-MLV反转录酶。所述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂还可包括突光显色剂。进ー步，所述突光显色剂可为姆4μ I试剂由I μ I浓度为625 μ mol/L的钙黄绿素溶液、I μ I浓度为12. 5mmol/L的MnCl2溶液和2 μ I灭菌超纯水组成。本专利技术所要解决的再一个技术问题是提供ー种检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。本专利技术所提供的检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物或上述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂。进ー步，所述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂盒还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可为HlNl亚型禽流感病毒RNA ;阴性对照可为灭菌超纯水。另外，上述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.检测或辅助检测H1N1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物 FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物 LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物 LF-N1和简并引物LB-N1组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、 序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各简并引物的 摩尔比为1.6umol所述简并引物FIP-Hl、1.6iimol所述简并引物BIP_H1、0. 2 y mol简 并引物F3-H1、0. 2iimol简并引物B3_H1、0. 8 y mol简并引物LF_H1、0. 8 y mol简并引物 LB-H1、L 6iimol所述简并引物FIP-NUl. 6iimol所述简并引物BIP-N1、0. 2iimol简并引物 F3-NU0. 2umol 简并引物 B3-NU0. 8umol 简并引物 LF-N1 和 0. 8umol 简并引物 LB-N1。3.检测或辅助检测H1N1亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒，其 特征在于所述试剂或试剂盒均包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和权利要求1 或2所述的成套引物。4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述试剂或试剂盒中包括二套 独立包装的试剂，分别为反应试剂A和反应试剂B ；所述反应试剂A含有1. 6 ii mol所述简并引物FIP-H1、1. 6 ii mol所述简并引物BIP-H1、 0. 2 y mo 1所述简并引物F3-H1、0. 2 y mo 1所述简并引物B3-H1、0. 8 y mo 1所述简并引物 LF-HK0. 8 u mol 所述简并引物 LB-H1、lmmol 所述 dATP、lmmol 所述 dCTP、lmmol 所述 dGTP、 lmmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和lmmol所述甜菜喊；所述反应试剂8含有1.61111101所述简并引物？1 41、1.61111101所述简并引物81 41、 0. 2 u mol所述简并引物F3-N1、0. 2 nmol所述简并引物B3_N1、0. 8 u mol所述简并引物 LF-NK0. 8 u mol 所述简并引物 LB-N1、lmmol 所述 dATP、lmmol 所述 dCTP、lmmol 所述 dGTP、 lmmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和lm...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，彭宜，刘加波，谢志勤，庞耀珊，邓显文，谢丽基，范晴，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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