本发明专利技术公开了一种检测黄病毒属病毒的CODEHOPRT-PCR试剂及方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为AATGTATGCAGATGATACAGCaggntgggayac的引物B1，下游引物溶液含有序列为TCTATCATCAATTGGTTTAACAACAcartcrtcncc的引物B2，引物B1和引物B2是由5＇端非兼并共有序列夹和根据保守氨基酸设计的很短的3＇端的核心简并区aggntgggayac或cartcrtcncc组成，扩增产物序列长度为421~445bp；可以扩增检测黄病毒属内病毒，是一种黄病毒属通用性检测试剂和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及黄病毒的检测技术，具体涉及ー种检测黄病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂及方法。
技术介绍
黄热病毒属病毒(Flavivirus)简称黄病毒,是黄病毒科的最大家族，已知由70多种病毒构成，其中40多种病毒与人类疾病相关，包括登革病毒(DENV)、こ型脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、西尼罗病毒(WNV)、Kujun病毒(KUN)、圣路易斯脑炎病毒和黄热病毒(YFV)等，其中大多数为虫媒病毒。近年来，以登革热病毒、日本脑炎病毒(こ型脑炎病毒)以及西尼罗病毒等为代表的黄病毒疫源地的不断扩大，已成为全球性的公共卫生问题。现有病原体检测技术体系和方法大多为単一病原的常规检测技术，如公开号为CN101629215A的专利技术专利申请，就公开了检测こ型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒 的多重试剂盒，利用各自的特异性引物对上述3种病毒进行检測。也有如授权公告号为CN100557027C的专利技术专利，公开了检测日本脑炎病毒血清群成员(JEV、WNV、圣路易斯脑炎病毒、KUN和河谷脑炎病毒)的试剂盒和方法，该试剂盒针对也仅是日本脑炎病毒血清群成员的试剂，不能检测出黄热病毒和蜱传脑炎病毒等其它的黄病毒属病毒。C0DEH0P RT-PCR技术是ー种可用于未知病原体检测的新技术，该技术依据病毒家族共有的保守蛋白氨基酸序列，通过专业软件，设计特定引物。当怀疑ー种未知病原体为某病毒或细菌家族的成员，或ー个未知基因是某基因家族成员时，可以用该技术进行验证。目前尚未有应用该技术对黄病毒属病毒群进行检测的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测黄病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂及方法，该检测试剂和方法为黄病毒属病毒通用检测试剂和检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种检测黄病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂，包括10XPCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTP液、Taq酶液、上游引物溶液和下游引物溶液，所述上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r为嘌呤,可以是g或a, y为喃唳,可以是c或tAi，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它。利用上述试剂具体检测黄病毒属病毒的方法的步骤如下 a、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒(购于Promega公司)对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板,具体逆转录方法依说明书进行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50 μ Μ) I μ L，上述约 RNA 10μ L,72°C 10. min，加入 5XRT buffer 4 μ L、dNTP液(IOmM) I μ L、AMV 反转录酶液(IOU/μ L) I μ L、RNA 酶抑制剂(20U/ μ L) O. 5 μ L、无 RNA酶水1.5yL，42°C lh，72°C IOmin ;反应产物即为后续的PCR模板； c、PCR反应在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer 2. 5 μ L、浓度为 25mM 的MgCl2溶液L 5 μ L、浓度为IOmM的dNTP液O. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、浓度为25 μ M上游引物溶液I μ L、浓度为25 μ M下游引物溶液I μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L组成的反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s, 720C延伸lmin，45个循环，72°C延伸7min，4°C保存PCR产物，上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有核苷酸序列为 TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc 的引物 B2 ; d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用重量百分浓度1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现42T445bp大小片段的条带,则为黄热属病毒。以上10XPCR buffer、MgC12、dNTP液、Taq酶液等反应试剂均购自大连宝生生物，引物由上海生工合成。上述引物BI、B2是根据Genbank已公布黄热病毒属15种病毒的基因组开放读码框(0RF)编码的多聚蛋白(polyprotein)氨基酸序列设计引物对,包括Kokobera virus,Aroa virus, Ilheus virus, Modoc virus, Spondweni virus, Yellow fever virus 17D/Tiantan,Dengue virus I,Japanese encephalitis virus,Louping ill virus,St. Louisencephalitis virus, Tembusu virus, West Nile virus, Murray Valley encephalitisvirus, Rio Bravo virus, Saumarez Reef virus。将蛋白质氨基酸序列以 FASTA 格式保存，输入http://blocks, fhcrc. org/codehop. html进行Block比对,得到高度保守的连续氨基酸区域。使用CodeHop引物捜索，常规方法筛选合适上下游引物，要求简并度低，上下游引物位置间距在500bp左右。利用primer和oligo软件进行引物分析,得到上述I对杂合寡核苷酸引物(上游引物BI和下游引物B2)，通过序列分析软件与Genbank中获得的42种典型黄热病毒属病毒株全基因比对，理论上均可获得42f445bp的扩增产物。与现有技术相比，本专利技术的优点在于适用于检测黄病毒属所有病毒的C0DEH0PRT-PCR的试剂和方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游弓I物溶液含有序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc的引物B2，引物BI和引物B2是由5'端非兼并共有序列夹和根据保守氨基酸设计的很短的3 '端的核心简并区aggntggga yac或cartc rtcncc组成,扩增产物序列长度为421 445bp ;引物中5 '端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下能稳定3 '兼并核心区与模板结合作用，允许在较高退火温度下进行，提高了兼并PCR反应的特异性，可以扩增检测黄病毒属内病毒，如こ型脑炎病毒、登革病毒、黄热病病毒、森林脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、圣路易脑炎病毒、鄂木斯本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂，包括上游引物溶液和下游引物溶液，其特征在于所述上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r为嘌呤,可以是g或a, y为喃唳,可以是c或tAi，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它。2.利用权利要求I所述ー种检测黄病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂检测黄病毒属病毒的方法，其特征在于步骤如下 a、RNA提取用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行，反应产物即为后续的PCR模板； c、PCR反应在O.2mL印pendorf管中加入10XPCR缓冲液2. 5 μ L、浓度为2...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡群，马思杰，孙肖红，郑剑宁，韩辉，倪红霞，
申请(专利权)人：中华人民共和国大榭出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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