本发明专利技术公开了一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，包括探针耦联编码微球、氯化四甲铵、TE、链酶亲和素-藻红蛋白及六种病毒特异性引物，其中下游引物5'末端经biotin修饰、六种病毒标准株基因组DNA阳性模板和96孔滤模板。本发明专利技术的病毒性脑膜脑炎诊断试剂盒是一种基于xMAP技术的液相芯片，它以病毒特异性寡核苷酸探针耦联荧光编码微球为反应载体，与检测样本中的病毒基因组进行杂交，通过Luminex200分析仪快速、特异、高通量地对病原体进行检测，因此优于传统和常规的生物学检测方法，该试剂盒可大大提高病毒性脑膜脑炎的诊断效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒性脑膜脑炎病原体的诊断，特别是一种针对造成病毒性脑膜脑炎的主要病原体，包括DNA病毒单纯疱疹病毒I型HSV-I、II型HSV-II和Epstein-Barr病毒；RNA病毒EV71、柯萨奇病毒CA16、埃可病毒ECHO的诊断试剂盒。
技术介绍
病毒性脑膜脑炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，常表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激症状等，可致中枢神经系统局灶性损害。病毒性脑膜脑炎预后不佳，死 亡率高，常留有严重后遗症。目前，病原体培养是感染疾病诊断的标准，但实际临床工作中，中枢神经系统感染的病原体检出十分困难，常常造成确诊困难，误诊率和漏诊率很高，而且该方法耗时、操作复杂；分子生物学中的PCR技术的应用可以帮助临床作出快速诊断，但因其灵敏度过高，容易出现假阳性；免疫学方法检测病原体特异性相关抗体，也是常用的一种诊断手段，但其阳性率较低而且一次只能筛查一种病原体，不能为临床提供有力依据。因此，寻找一种早期快速、灵敏特异、一次可筛查多种病原体(高通量)的实验诊断方法就突显其重要性。近年来出现的高通量xMAP技术为我们解决中枢神经系统感染的病原诊断带来了希望。它的核心技术是在不同荧光编码的微球共价耦联寡核苷酸、抗原、抗体、酶、底物、配体或受体形成微球生物探针(包括寡核苷酸及蛋白生物探针)，之后将不同的微球混合，与待测样品(如血清、脑脊液、PCR产物等)进行反应或杂交。待微球与样品中抗原、抗体或核苷酸结合后，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应。因此xMAP技术是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改进已有检测方法的不足，依靠xMAP技术平台，实现快速，敏感特异，高通量检测病毒性脑膜脑炎病原体，对诊断疾病具有重要的临床应用价值。本专利技术实现过程如下 一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，包括下列部件1)探针耦联编码微球A液，I管，内装6种不同微球分别耦联六种病毒探针； 2)B液，I管，内装I. 5X氯化四甲铵(I. 5XTMAC); 3)C液，I管，内装IX氯化四甲铵(IXTMAC); 4)D 液，I 管，内装 I XTE，pH 8.0 ； 5)E液，I管，内装链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；6)F液，引物，6管，分别装有六种病毒特异性引物，其中下游引物5’末端经biotin修饰；7)阳性对照G液，6管，分别装有六种病毒标准株基因组DNA阳性模板； 8)96孔滤模板，I张。上述基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其六种病毒探针及引物是根据各自基因保守区序列设计的，探针的5’末端用H2N-C12标记，其DNA序列分别如下 探针序列(5’-3’ )HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACAGCTGCCAACACTGAA下游引物一ACCATCCGTGITCTGTGTACC - biotinECHO :上游引物一 CCAGGATGTCGATACCATTCATGAG下游引物一TCACCCCTTGCACATCAAAGITGAC - biotin。上述基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒的使用方法，按下列步骤进行 (1)病毒基因组DNA或RNA提取，RNA需逆转录为cDNA； (2)设计五种病毒引物，下游引物5’末端用Biotin修饰，进行PCR扩增产物； PCR 扩增反应体系包括10XMulti Hotstart Buffer、超纯 dNTP (2.5 mM each), DNAPo I ymerase、上游引物、下游引物、基因组DNA模板、UDG、dUTP、ddH20 ； 按下列条件扩增 95° C 10 min 预变性，一94° C 30 sec 35 个循环一72° C 10 min —4° C 保存 57。C 90 sec 72。C 60 sec ； (3)杂交检测 I)准备探针微球混合工作液用I. 5 X TMAC杂交液B液使探针微球A液的浓度稀释为每种微球150个/ ii 1，震荡混匀； 2分别向样本管、阳性对照管、阴性对照管和空白管加入33 Ul探针微球混合工作液； 3)向各样本管、阳性对照管和阴性对照管依次对应加入5 u I已生物素化的PCR产物，空白管加入5iU ddH20，然后向各反应管补加pH 8. O的TE buffer D液，使反应总体积为50u I ； 4)将各反应管置于PCR仪，设置反应条件，95°C 5 min, 55° C 15 min ； 5)在第4步同时，用C液IXTMAC配制新鲜的31^/ml的SA-PE，震荡混匀； 6)将第4步中的反应液转移入预湿的96孔滤模板孔内，负压真空抽滤除去上清，依次向每孔加入100 W 3Pg/ml的SA-PE，震荡混匀，室温避光孵育IOmin ;迅速将96孔滤模板转移至LumineX200液相芯片检测仪内，设置杂交温度后进行检测；检测样本的荧光信号值大于四倍阴性对照荧光信号值则为阳性，反之视为阴性。 本专利技术选择6种常见病毒性脑膜脑炎病原体的特异性基因，从GenBank获得保守基因序列，进行序列比对，保证其特异性。应用oligo6. 65设计特异性引物及寡核苷酸探针，通过生物信息学分析和试验验证，筛选出针对六种病原体的6对特异性引物及相应的探针。首先用5’-H2NC12标记的寡核苷酸探针包被不同编码微球作为反应载体，然后将各种探针荧光微球混合，制作悬浮芯片，与单重或多重PCR扩增片段进行杂交反应，最后应用Luminex200流式荧光微球检测分析仪进行定性和定量检测。这种技术可以同时检测六种病毒性脑膜脑炎病原体，而且可检测到Pg级DNA含量，具有很高的特异性和灵敏性。本专利技术的病毒性脑膜脑本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于包括下列部件 (1)探针耦联编码微球A液，I管，内装6种不同微球分别耦联六种病毒探针； (2)B液，I管，内装I. 5X氯化四甲铵； (3)C液，I管，内装IX氯化四甲铵； (4)0液，1管，内装1父丁￡，？118. O ； (5)E液，I管，内装链酶亲和素-藻红蛋白； (6)F液，引物，6管，分别装有六种病毒特异性引物，其中下游引物5’末端经biotin修饰； (7)阳性对照G液，6管，分别装有六种病毒标准株基因组DNA阳性模板； (8)96孔滤模板，I张。2.根据权利要求I所述的基于xMAP技术的快速诊断病毒性脑膜脑炎试剂盒，其特征在于六种病毒探针及引物是根据各自基因保守区序列设计的，探针的5’末端用H2N-C12标记，其DNA序列分别如下 探针序列(5’-3’ )HSV-I TCCGTGTTCACCACGAGTACCTGCGTCACCHSV-II CGCGCTTATGGACACACCACACGACAACAAEpstein-Barr CGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGAEV71 CATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCA 16 :GATGCCAACACGGTGTAGTAGGAATTGTCTECHO CTATGATGGATGGTCTCACTTCAGTCAGAG引物序列(5’-3’ )HSV-I 上游弓 I 物一GCCGTTGAGCTAGCCAGCGA下游引物一 GTGCTGGTGCTGGACGACAC-biotinHSV-II 上游引物一GTAAGCGCGGGCCAAAGGAT下游引物一TCAAACACGGAAGCCCGAAC - biotinEpstein-Barr :上游引物一CCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAG下游引物一AGCCAACCATAGACCCGCTTCCT - biotinEV71 :上游引物一 GAGCCCTCACTCATGCTCTAC下游引物一AGITGTGCCTTCAAGAGGGAG - biotinCA 16 :上游引物一 CCTACA...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵钢，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：
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