MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞，包括以下步骤：(1)MSCs或ASSCs培养与传代：①原代培养；②消化传代；(2)前体诱导；(3)功能诱导；(4)性能稳定培养。MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞的微囊化制备方法，采用ANano-P-ANano(海藻酸钠+纳米微粒-聚氨酸-海藻酸钠+纳米微粒)法，经静电微囊发生器使MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞微囊化微囊化；每微囊含20个或30个5-HT神经细胞组，使微囊内的细胞充分接触微囊壁，易于附着与营养交换，即制成微囊化诱导型5-HT神经细胞。微囊化诱导型5-HT神经细胞的应用，用于制备治疗抑郁症的药物或抗癌药物。本发明专利技术的微囊化诱导型5-HT细胞，该微囊化人5-HT神经细胞中枢移植疗法，将为临床治疗抑郁症及抗癌治疗提供新的途径。
【技术实现步骤摘要】
MSCs,ASCs诱导的5-HT神经细胞及其微囊化制备方法与应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及干细胞诱导5-HT神经细胞与细胞隔离(微囊化) 技术和方法，具体的说，是MSCs、ASCs诱导的5-HT神经细胞及其微囊化制备方法与应用。
技术介绍
( 一 ) 5-HT神经细胞对中枢联系和调节广泛5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)神经细胞或神经元主要位于脑干中缝核、黑质致密部、蓝斑尾部和下丘脑，其发出纤维几乎投射至整个中枢神经系统，上行至边缘系统(海马、隔核、下丘脑)和大脑新皮质(额、顶、枕、颞、岛叶)的广泛区域；下行至脊髓的前角躯体运动和侧角内脏运动(交感和副交感)神经元。其生理功能显示中缝核、孤束核、下丘脑、杏仁核、海马等处的5-HT神经元及纤维与睡眠调节有关，海马、杏仁核和额叶等处的神经元协调情绪和行为。我们利用动物2. 5 %多聚甲醛足底注射通模型实验，经背侧海马刺激镇痛显示中脑中央管周围灰质(PAG)和脊髓后角5-HT表达增多，表明5-HT及其神经元参与镇痛。有实验还显示破坏中缝核头端，非快速动眼睡眠完全消失，用5-HT合成抑制剂可引起完全失眠，并诱发脑电波异常放电，侧脑室注射5-HT酸可消除这一现象， 这些实验结果证实5-HT神经元及其递质5-HT参与机体睡眠、情绪、行为和镇痛等多功能调节，即5-HT神经元对中枢神经系统的正常功能具有重要的调节作用。( 二)长期应激导致5-HT神经细胞功能失代偿-表现抑郁研究资料表明，中枢系统内5-HT神经元释放5-HT参与应激调节，当中枢神经系统 5-HT表达水平降低时，易发生心理应激损伤。这种心理应激损伤可以引起两个后果①使抑郁症发生的风险及患抑郁症的严重程度增力口，其作用机制主要是中枢5-HT水平低下一肾上腺轴功能亢进一当机体受到创伤性事件刺激后一植物神经系统过度兴奋一通过一系列反应使得去甲肾上腺素和肾上腺素水平升高，此时由于中枢5-HT神经元释放5-HT的水平低下而对这两种激素释放进行的反馈性调节不能达到正常，导致持续性肾上腺轴机能亢进；②中枢5-HT水平低下一对海马的调节功能不足，由于海马属于中枢边缘系统的重要部分，5-HT —海马通路对不明原因导致过早启动的伤害性应激具有阻止效应，因而5-HT水平降低所致的海马失调节，可引起行为“脱抑制”(对环境刺激过度敏感)，易于发生应激性机体伤害。许多研究资料也证明了，抑郁症患者体内神经递质的异常主要表现为血和脑脊液内5-HT浓度降低，尸检也发现脑组织内5-HT含量降低。另外，一些关于越战抑郁症患者的研究也提示了机体内5-HT含量的降低，与战时失去正常的自我控制能力甚至战后罹患“战后综合症”有着密切的关系。还有研究显示，5-HT对NE神经元兴奋的高位脑区具有抑制作用；而NE神经元高度兴奋亦可抑制中缝核的5-HT神经元活动。当5-HT减少时则导致NE 通路持续兴奋，引起失眠、焦虑、抑郁等，进而导致5-HT再度减少，更加重睡眠与情绪障碍， 两者互为因果，由此形成恶性循环。因此，依据抑郁症脑的5-HT减少，或者5-HT耗竭或原本其合成释放水平低下易发病为病因，临床上应用5-HT再摄取抑制剂治疗抑郁症，部分患CN 102533653 A者取得了较好的效果。而部分患者无效，甚至出现严重的副作用，这极可能属于难治型或重症抑郁症，源于其中枢5-HT水平过低。我们采用国际公认的慢性应激动物模型，经蛛网膜下腔5-HT神经元移植显示可阻止动物行为异常和多器官损伤的发生，表明5-HT细胞移植可预防和治疗抑郁症或者应激对机体所致的伤害。(三)中枢5-HT水平过低导致周围器官病变-癌变易感有关肿瘤发生机制的研究报道，中枢5-HT水平低下可能使某些器官细胞癌变易感或者癌细胞易于恶化(演进)，其机制可通过中枢一周围(迷走等)神经一器官细胞的调节功能低下与神经内分泌肾上腺轴功能亢进，通过糖皮质激素、肾上腺素和去甲肾上腺素过量分泌，使器官细胞的能量代谢低下与毒性分子-兴奋性氨基酸和氧自由基(诱导型一氧化氮iNO、丙二醛MDA)的堆积一器官细胞抗损伤或修复功能障碍所致，如食管squamous cell carcinoma(ESCC)，虽然病因学早已提示食管癌变与环境 (食物霉变、亚硝胺)、遗传易感等因素有关，但近年来的研究表明，食管癌属慢性疾病，心理应激因素(精神创伤或抑郁)在食管癌变中占有重要地位，且神经-胆碱能抗炎通路 (cholinergic antiinflammatory pathway, CAP), CAP通路中迷走神经对应激引起的内脏损伤保护作用也需要通过脑干中缝核5-HT功能的激活。由于中枢5-HT参与应激调节，慢性心理应激或抑郁可导致脑内5-HT长期处于低水平状态，因而心理应激一中枢5-HT水平低下对食管黏膜上皮细胞癌变具有密切关系。另有Toh S等经对应用抗抑郁药5-HT再摄取抑制剂调查比较，发现用药人群的肺癌发病率降低。Pyroia S经肝切除+N-亚硝基二乙胺(NDEA)诱发肝肿瘤，发现脑干和大脑皮质5-HT2C受体结合力在肝肿瘤形成过程中升高， 即提示5-HT水平过低。El-Salhy等将奥曲肽(胃肠道止血药)、galanin(神经递质调节肽-可调节食欲，诱导细胞凋亡等)和5-HT等三联对胃肠癌细胞具有更好的抗癌作用。我们最近采用5-HT细胞蛛网膜下腔移植防治应激+亚硝胺食管癌的动物实验显示，慢性应激可导致食管癌变加速与恶化，而5-HT细胞移植可使鼠食管癌变减缓或发病率降低。(四)中枢5-HT不足周围器官病变机制之一神经通路功能失常有关中枢5-HT神经元一迷走神经胆碱能通路调节异常与内脏伤害或其细胞癌变关系的研究显示，由中枢5-HT神经元一迷走神经胆碱能一内脏的通路已经明确，经迷走神经及其节后纤维释放ACh作用于细胞的AChR (镶嵌在细胞膜内的糖蛋白)，以调节内脏器官或效应细胞。Grozio等研究报道胆碱受体具有调控细胞功能、增殖、转化和分化的作用，受体的亚型差异在细胞增殖-分化或肿瘤发生-恶性转化中起着重要作用，分别采用 nAChR-a 7或mAChR-3拮抗剂可抑制肺癌细胞增生。有研究证实，癌细胞分化程度愈低， AChRs亚型减少愈显著，结合位点丢失愈多。我们通过ACh对食管癌高、低分化细胞(高分化EC9706、低分化EC109)分别培养21天，发现ACh可使食管癌细胞AChR、基因损伤修复因子I^rxl、细胞分化钙依赖调节蛋白Annexin2和细胞骨架蛋白Keratins表达上调，形态趋向分化。我们近来的动物实验结果显示，切断迷走神经可加速亚硝胺对食管上皮诱发的癌变，此可能与消弱了 CAP通路的保护作用有关。结合TPH2基因多态为氧化还原，参与性易感和迷走神经功能削弱可使应激+亚硝胺诱发食管癌变加速，此可解释近些年对食管癌高发区随访新发现食管癌变发展不稳定的特点，即部分食管癌患者不治疗而愈或多年存活病变程度维持不变，这提示人类癌细胞具有诱导分化(可逆转)的能力，经中枢-迷走神经-器官功能的良性调节，可以起到抑制癌细胞，控制病情或达到治愈的目的，即经改善中枢5-HT 系统一迷走神经通路和节后神经递质AChR功能对有关癌细胞的转化与分化具有良性影响。由此表明，中枢5-HT和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴爱群，缪震元，王常勇，张喜，傅强，张子腾，常骁，王晓涵，吴帅，何星，李振强，高永俊一，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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