真皮干细胞的分离方法技术

本发明专利技术提供一种真皮干细胞的分离方法，其特征在于，通过进行酶处理将从皮肤上解离的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种从皮肤组织中分离真皮干细胞的方法。
技术介绍
干细胞是兼具产生分化为多个细胞的细胞的多分化能力、和通过细胞分裂产生与该细胞相同的细胞的自我复制能力这两种性质的细胞。源自作为受精卵的初期发育阶段的胚的干细胞被称为胚胎干细胞(ES细胞)。虽然人ES细胞被期待用于再生医疗，但由于存在利用受精卵这样的伦理上的问题，因此，制作新的人ES细胞尚未被认可。近年来，作为具有ES细胞类似性质的细胞，诱导多能干细胞(iPS细胞)也受到关注。但是，iPS细胞的制作在细胞癌化、制造功效等观点方面有许多问题。另一方面，具有分化为特定组织的能力的体性干细胞可由患者自身的身体组织、例如骨髓得到，因此，没有胚胎干细胞那样的伦理上的问题。在皮肤中，已知在表皮基底层存在表皮干细胞(非专利文献1)，还报告在毛囊的被称为隆起区的区域存在毛囊上皮干细胞(非专利文献幻和皮肤色素干细胞。另一方面， 在真皮中，在以胶原蛋白为主的纤维组织中存在形成细长纺锤形的成纤维细胞，但在真皮的成纤维细胞中是否存在干细胞尚未明确。虽然已知在真皮中存在分化为脂肪、神经胶质、 软骨、肌肉等多个细胞系列的皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors :SKP)(非专利文献4)，但真皮成纤维细胞与SKP的关联尚未明确。作为成纤维细胞的前体细胞而从骨髓中被分离出的间充质干细胞(非专利文献 5)分化为属于间充质的各种细胞(骨细胞、肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等)，因此， 期待应用于骨、血管、肌肉的再构筑等再生医疗。最近，已明确具有间充质组织的组织可能大量存在，从脂肪、脐带血、胎盘等中分离出了间充质干细胞(非专利文献6-8)。但是，真皮中的间充质干细胞的存在依然未明确。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Watt FM, J Dermatol Sci. 28 173-180，2002非专利文献2 =Cotsarelis G et al.，Cell. 57 :201-209,1989非专利文献3 =Nishimura EK et al.，Nature. 416 :854-860,2002非专利文献4 =Wong CE al.，J Cell Biol. 175 :1005-1015,2006非专利文献5 =Pittenger MF et al.，Science. 284 143-147，1999非专利文献6 =Park Kff et al.，Cell Metab. 8 :454-457,2008非专利文献7 =Flynn A, et al.，Cytotherapy. 9 :717-726,2007非专利文献 8 Jgura K et al.，Cytotherapy. 6 :543-553,200
技术实现思路
专利技术要解决的课题骨髓的间充质干细胞非常微少，脐带血及胎盘限定对象，因此，作为源自自身的间充质干细胞源有限。如果能够从真皮中分离出间充质干细胞，则皮肤可成为再生医疗及美容医疗中使用的间充质干细胞的宝贵的供给源。因此，本专利技术的课题在于，提供一种从真皮中分离间充质干细胞的方法。本专利技术者为了明确在真皮中存在间充质干细胞，同时确立有效地分离间充质干细胞的方法而进行了研究，结果实际确认了相对于干细胞标记物为阳性的细胞存在于真皮毛细血管及血管周围。但是，如果为了解离该细胞将皮肤组织进行酶处理，则特定的干细胞标记物的表达明显减少。本专利技术者对酶处理后的该细胞进行悬浮培养，结果明确了不仅该干细胞标记物的表达恢复，而且与粘附培养后的培养物相比，保持了高分化能力，从而完成了本专利技术。因此，本申请包括下述专利技术(1) 一种，其特征在于，将通过酶处理从皮肤上解离出的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。(2)根据上述⑴所述的方法，所述干细胞标记物阳性细胞是CD34阳性细胞。(3)根据上述(2)所述的方法，所述CD34阳性细胞进一步是NG2阳性。(4)根据上述⑴ (3)的任一项所述的方法，所述悬浮培养，进行对于使所述细胞的干细胞标记物的表达恢复所需足够的时间。专利技术的效果虽然不打算限定于理论，但一般认为，真皮干细胞以周细胞样的细胞群的形式存在于微脉管部位，在皮肤损伤时活化，分化为成纤维细胞、肌成纤维细胞，参与皮肤的再生和/或修复。另外还推测，真皮干细胞因年龄增长、皮肤刺激等被消耗，结果除了导致皮肤功能降低以外，还造成皮肤再生能力降低、血管不稳定化，从而产生皮肤老化。根据本专利技术方法，可以容易地分离真皮干细胞。通过本专利技术得到的真皮干细胞被期待有助于阐明皮肤的稳态、老化等机理，和/或应用于使用该干细胞的再生医疗。附图说明图1是按照本专利技术的方法，通过将从人真皮中分离出的细胞中的粘附性高的细胞在间充质干细胞培养基中进行培养而得到的成纤维细胞样的细胞的显微镜照片。图2显示由图1所示的成纤维细胞样的细胞形成的菌落。图3显示图1所示的成纤维细胞样的细胞分化为脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。图4是使用了干细胞标记物CD34和NG2以及核染色剂Hoechst33258的真皮中的血管部位的组织染色图。图5是对通过从人真皮进行CD34细胞分选而得到的细胞级分的菌落形成能力进行比较的显微镜照片；图6是显示源自人真皮的CD34阳性细胞是分化为脂肪和骨的真皮间充质干细胞的显微镜照片；图7是显示按照本专利技术方法获得的真皮干细胞中的间充质干细胞标记物NAN0G、 SDF-I α、HGF的基因表达比的图。在此，该表达比是与通过粘附培养而得的干细胞的表达量比较后的结果。具体实施例方式本专利技术提供一种分离真皮干细胞的方法，其特征在于，将通过酶处理从皮肤中解离出的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。在此，对上述源自皮肤的细胞没有限定，可以按照从骨髓中分离间充质干细胞的方法使其解离。例如，对细切后的皮肤组织进行酶处理，使真皮细胞从皮肤组织中解离。该酶处理可以使用胰蛋白酶、胶原酶等一般的蛋白质分解酶来进行。使用的皮肤组织为哺乳动物的皮肤组织，优选为源自人的皮肤组织，但并不限定于这些皮肤组织。在这种受到酶处理的细胞中，特定的干细胞标记物的表达低下。在此，本说明书中使用的用语“干细胞标记物”是指在对分离真皮干细胞有效的干细胞标记物中，特别由于从组织中解离时因酶处理而使其表达降低的标记物，例如指细胞表面抗原⑶34。如下所述，本专利技术者确认，作为造血干细胞已知的细胞表面抗原CD34在真皮中的血管部位表达，但刚酶处理后的细胞的CD34表达量极低。因此，即使对通过酶处理而得到的源自皮肤的细胞使用流式细胞仪，也不能充分地分离干细胞标记物阳性的细胞。另外，酶处理后的细胞的干细胞阳性标记物的表达在进行作为间充质干细胞的一般培养方法的粘附培养的情况下也显著低下。但是，明确了通过将对皮肤组织进行酶处理而得到的细胞在规定期间进行悬浮培养， 从而干细胞标记物的表达恢复。更令人吃惊的是，与通过粘附培养而得到的真皮干细胞相比，经由悬浮培养分离而得到的真皮干细胞显示高分化能力。所述悬浮培养进行对于恢复降低的干细胞标记物的表达足够的时间，例如4小时，根据情况可进行数天，例如5天。从利用糖链等的干细胞标记物的翻译后修饰的观点考虑，悬浮培养优选进行6小时。该悬浮培养可使用间充质干细胞所使用的培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：相马勤，山西治代，
申请(专利权)人：株式会社资生堂，
类型：发明
国别省市：