本发明专利技术涉及基因克隆领域，特别涉及青虾甲壳类高血糖激素(Crustaceanhyperglycemichormone，CHH)基因和编码蛋白及其克隆方法。利用本发明专利技术提供的引物组从青虾眼柄组织中克隆到了一种CHH基因，为研究CHH基因参与血糖调节、脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用等提供理论参考，为青虾繁殖生理功能研究奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
专利技术涉及CHH基因，具体地说是一种青虾(Mcrobrachium nipponense) CHH基因和编码蛋白及其克隆方法。
技术介绍
CHH家族激素在调控甲壳运物的蜕皮、变态发育、生殖、血糖平衡以及体内的渗透压等方面起着重要的作用。甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone, CHH)是 CHH 家族的一员，可以通过调控磷酸化酶、糖原合成酶以及中肠淀粉酶活性使无眼柄的甲壳动物血糖增加，CHH根据内部信号如血淋巴中葡萄糖量，外部信号如缺氧、寄生虫感染、热激、污染物等做出反应。除了糖代谢外，CHH也参与脂代谢(Santos等，1997)、控制鳃的离子转运(Pienot 等，2000)以及调节渗透压。研究表明，克氏原鳌虾iProcmibariis clarkii)的CHH异构体对大颚器官MF的合成具有抑制作用(Laufer等，1994)，同样无缘蜘蛛蟹Hibinia emarginata)的CHH异构体也对MF的合成也具有调节作用(Liu等，1997)。许多证据显示CHH对生殖具有促进作用Jensen等(1989)利用异源体内生物活性检测的方法，发现美洲鳌龙虾(Homarus americanus)的两种CHH-B的异构体对来自无常小长臂虾(Palaemonetes varians)的非卵黄发生期的卵细胞的生长具有促进作用，另外在同源体外生物活性检测中也发现两种CHHB异构体对生殖具有促进作用(Van Herp, 1992) 0 雌性美洲鳌龙虾卵黄发生前期CHH-A与CHH-B的mRNA水平及眼柄中CHH的浓度显著变高， 在卵成熟过程中，血淋巴中的CHH-A与CHH-B浓度亦变高，而GIH浓度变高的阶段则出现在卵黄发生前期及未成熟期。这一结果表明，CHH-A与CHH-B对卵黄发生起着激发作用，GIH 则对卵黄发生起着抑制作用。甲壳类高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)，是甲壳动物眼柄中含量最丰富且被研究的最多的激素。目前关于青虾CHH的研究尚未进行。因此，本专利技术以青虾眼柄为材料，分离了青虾CHH的全长cDNA序列，并对其所编码的神经肽的序列特征、 同源性、进化地位进行了分析，为全面掌握其生理功能提供了基础资料，为进一步研究青虾 CHH基因的表达、调控奠定了基础，同时也为甲壳动物整个CHH家族的功能和进化研究提供了新的材料。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供克隆青虾CHH基因系列的引物组和编码蛋白及其克隆方法。利用本专利技术提供的引物组首次从青虾眼柄中克隆到了一种CHH基因，为进一步研究CHH 基因参与血糖调节、脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用等奠定基础，为青虾繁殖生理功能研究提供参考。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案本专利技术提供了扩增青虾AST基因全长cDNA序列的引物组，其由如下引物组成 引物组1:正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 引物组2 正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。引物组3:正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。本专利技术还提供了一种克隆青虾CHH基因全长序列的方法，包括如下步骤 步骤1 从青虾眼柄中提取总RNA ；步骤2 然后RT进行cDNA第一链合成；步骤3 用引物组1扩增获得青虾CHH基因才cDNA序列中间片段；所述引物组1由如下引物组成正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；步骤4 用引物组2扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的3’端片段；所述引物组2由如下引物组成正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向外引物3' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示； 反向内引物3' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。步骤5 用引物组3扩增获得青虾CHH基因cDNA序列的5’端片段；所述引物组3 由如下引物组成正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示； 正向内引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示； 反向外引物5' RACE Outer Primer的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示； 反向内引物5' RACE Inner Primer的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。步骤6 将所述CHH基因的3’端和5’端片段拼接，即得。作为优选，步骤4和5所述扩增为套式两轮PCR。本专利技术以青虾眼柄组织为材料，分离了青虾CHH基因全长序列，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链反应(NeSted-PCR)、3，端cDNA快速扩增(3，-RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5’ -RACE)的方法，对青虾CHH基因进行了研究，首次从青虾眼柄组织中克隆到了 CHH基因全长序列，并对其所编码的神经肽的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，为进一步研究青虾CHH基因的表达、调控奠定了基础，为CHH基因参与血糖调节、 脂代谢、离子转运、渗透压以及促进卵黄生成作用的研究提供参考，同时也为甲壳动物CHH 基因功能和进化研究提供了新的背景资料。附图说明图1为青虾CHH前体与其它甲壳动物CHH前体的氨基酸序列比对，其中竖线“ |，， 表示信号肽和二盐基的切割位点；图2为CHH前体的NJ系统进化树。 具体实施例方式本专利技术公开了扩增青虾CHH基因全长序列的引物组和编码蛋白及其克隆方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供了扩增青虾CHH基因全长序列的引物组，其由如下引物组成 引物组1:正向引物FSl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 引物组2 正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 正向内引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 反向外引物3' RACE Outer Primer的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴滟，王宁，傅洪拓，乔慧，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
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