一种增殖多能性干细胞的方法技术

为了在不使用支持细胞、血清等动物性材料的体系中有效地增殖多能性干细胞，本发明专利技术提供了一种增殖多能性干细胞的方法，其包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白－５的体系中培养该多能性干细胞的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种增殖多能性干细胞的方法
本专利技术涉及增殖多能性干细胞的方法、层粘连蛋白-5作为细胞支持材料(cell-supportingmaterial)的用途以及多能性干细胞的培养用试剂盒。本申请以2008年3月31日提出的日本专利申请特愿2008-93350和2008年9月3日提出的日本专利申请2008-225686号为基础要求优先权。
技术介绍
多能性干细胞的增殖方法多能性干细胞为具有分化成所有组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞。作为多能性干细胞，目前已知有胚胎干细胞(ES细胞)、通过在体细胞中导入并表达特定因子的组合(例如，Oct3/4，Sox2，Klf4及c-Myc的组合)而制作的诱导多能性干细胞(iPS细胞)、通过原始生殖细胞制作的胚胎生殖干细胞(EG细胞)、通过精巢的生殖细胞制作的种系干细胞(GS细胞)等。胚胎干细胞(EmbryonicStemCells：ES细胞)是通过发育初期的胚泡内细胞群(ICM)建立的多能性干细胞(Nature.292，154-156，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78，7634-7638，1981，Science.282，1145-1147，1998)。小鼠ES细胞在白血病抑制因子(LIF)的存在下能够维持其多能性(Nature.336，684-687，1988，Nature.336，688-690，1988)。通常，在维持培养中使用产生LIF的细胞株或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为支持细胞(饲养细胞)，或者使用添加有LIF的培养基和适当的支持材料。小鼠ES细胞的培养中，支持细胞担负着提供细胞粘附的支架及供给ES细胞生长因子和LIF的任务。另外除了从支持细胞供给LIF外，还可以在培养液中添加LIF。作为添加LIF的方式，可以直接将LIF添加到培养液中，也可以在培养液中添加产生LIF的细胞株的培养上清。另一方面，在不使用支持细胞的体系中，通过以明胶等各种胞外基质作为支持材料、并向培养液中添加LIF来进行小鼠ES细胞的培养。另一方面，在人ES细胞的培养中，为了维持多能性，需要存在碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)(DevBiol.227，271-278，2000)，进而还需要从MEF供给的因子。人ES细胞在FGF2存在下，通过使用MEF作为支持细胞，或者使用MEF的培养上清和适当的支持材料，能够在保持多能性的状态下进行维持培养(NatureBiotech.19，971-974，2001)。具体而言，在FGF2和血清存在下能够培养人ES细胞，或者也可以用无血清的培养基培养人ES细胞。现在一般采用的是用无血清培养基培养人ES细胞，作为血清代替物可使用例如Invitrogen公司的KNOCKOUTTM血清替代品(KSR，knockoutserumreplacement)等。作为一般的人ES细胞的培养体系，可以使用如下的体系：使用MEF作为支持细胞并将FGF2添加到培养液中的体系、以Matrigel等各种胞外基质蛋白作为支持材料并在添加有FGF2的MEF培养上清中进行培养的体系。另外，作为支持细胞不仅可以使用小鼠成纤维细胞，还可以使用人成纤维细胞。此外，据报道，近年来在小鼠和人中由体细胞建立了具有与胚胎干细胞非常相似的性质的诱导多能性干细胞(inducedPluripotentStemcells：iPS细胞)(Cell.126，663-672，2006，Cell.131，861-872，2007，Science.318，1917-1920，2007，国际公开WO2007/069666)。iPS细胞为在体细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等因子而建立的体细胞来源的多能性干细胞。一般在iPS细胞的维持培养中，与ES细胞同样也需要存在支持细胞。iPS细胞可通过与ES细胞同样的方法进行培养。在STO细胞(稳定产生LIF的SIM小鼠成纤维细胞株)中、使用LIF产生细胞的培养上清能够维持培养小鼠iPS细胞。并且，作为不使用支持细胞的体系，通过在培养基中添加LIF，能够在包被有明胶的培养板上维持培养小鼠iPS细胞。另外，据了解，STO细胞对于稳定维持小鼠来源的ES细胞、EG细胞、EC细胞是有效的。人iPS细胞还可以利用小鼠成纤维细胞作为支持细胞并在添加有FGF2的体系中进行培养。另外京都大学山中伸弥等的研究小组，使用SNL细胞(小鼠成纤维细胞株，同时表达LIF和G418耐性基因)进行培养(Cell.131，861-872，2007)。在不使用支持细胞的体系中维持培养人iPS细胞的情况下，采用使用Matrigel作为支持材料并在MEF的培养上清中添加了FGF2的体系。体细胞来源的iPS细胞与初期胚来源的胚胎干细胞相比，伦理性的问题较少，并且，由于可由患者本人的细胞进行调制因此并不存在免疫排斥的问题。可期待其在再生医疗上的应用。胚胎生殖干细胞(Embryonicgermcells：EG细胞)为在青灰因子(Kit-Ligand)、LIF、FGF2的存在下培养原始生殖细胞而建立的细胞，通过小鼠的实验可知该细胞具有与ES细胞大致相同的性质。EG细胞的维持培养可以使用与ES细胞同样的培养方法。即，在MEF、STO细胞等支持细胞的存在下，能够在添加有LIF的体系中培养EG细胞。(Cell70：841-847，1992，Development120，3197-3120，1994)。由精巢的生殖细胞制作的种系干细胞(GermlineStemcells：GS细胞)是通过在至少含有GDNF(Glialcell-linederivedneurotrophicgrowthfactor，胶质细胞源性神经营养因子)的培养条件下进行培养从而能够在体外培养精原干细胞(精子干细胞)的细胞株，通过注入到精巢的曲细精管(seminiferoustubules)内而能够形成精子。GS细胞的长期培养可通过在作为支持细胞的MEF上使用添加有GDNF、FGF2、EGF(epidermalgrowthfactor)及LIF的培养基来进行。还有在无支持细胞的体系内培养GS细胞的报道，其通过在用层粘连蛋白包被后的培养板进行培养，能够维持GS细胞(BiologyofReproduction69：612-616，2003，BiologyofReproduction72：985-991，2005)。GS细胞中尤其是mGS细胞(multipotentgermlinestemcell)，具有与ES细胞同样的性质，还具有分化多能性。mGS细胞通过在ES细胞的培养体系中使所建立的GS细胞进一步变成多能性干细胞而建立。所建立的mGS细胞也能够采用与ES细胞同样的方法进行培养，可在支持细胞存在下且在使用了添加有LIF的培养基的体系中进行培养。(Cell119：1001-1012，2004，Nature440：1199-1203，2006)。上述那样的多能性细胞被期待应用在再生医疗等中。但是，为了应用在临床上而尤为需要避免免疫排斥的问题、未知的病毒混入等潜在的危险性，可以说需要开发完全不使用动物来源的物质的维持培养体系。即，可以预料，当人所不具有的动物来源的唾液酸被吸收到人ES细胞、iPS细胞时，这些唾本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白－５的体系中培养该多能性干细胞的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP2008-0933502008年3月31日1.一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在由人层粘连蛋白-5或由人层粘连蛋白-5和胶原蛋白处理过的培养容器中培养该多能性干细胞的工序，所述多能性干细胞为诱导多能性干细胞，所述人层粘连蛋白-5的浓度为0.5～15μg/ml。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诱导多能性干细胞为人的诱导多能性干细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在培养基中含有血清替代品。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述血清替代品含有：选自由甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸组成的组中的1种或多种氨基酸；由硫胺素和/或抗坏血酸组成的维生素；选自由银、...

【专利技术属性】
技术研发人员：保田尚孝，
申请(专利权)人：东方酵母工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP