一种猪细胞培养基制造技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清。本发明专利技术还涉及一种培养猪细胞的方法，一种胎猪血清以及所述胎猪血清在培养猪细胞或者制备猪细胞培养基中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清。本专利技术还涉及一种培养猪细胞的方法，一种胎猪血清以及所述胎猪血清在培养猪细胞或者制备猪细胞培养基中的用途。
技术介绍
培养基既是细胞培养中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。目前主要使用的是在合成培养基中加入天然成分而成的完全培养基。完全培养基由基础培养基(如MEM)和添加成分(如血清，或对于无血清的培养基，使用激素及生长因子)组成。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5％-20％(v/v)。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作细胞增殖用，也用于细胞系和原代培养，而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。目前，猪细胞培养基主要是由基础培养基DMEM和/或F12与胎牛血清构成的完全培养基，同时，这种培养基也广泛应用于其它种类细胞的培养。胎牛血清来源较为容易，产量较大，是普遍使用的血清。但猪细胞在此种培养基上培养时细胞生长状态和细胞的增殖速度都较为有限，细胞的传代次数也受到了很大的影响。目前在猪的细胞培养方面依然缺少较为理想合适的培养基。对此，本专利技术人研制了一种猪细胞培养基，其中在基础培养基中加入胎猪血清替代胎牛血清，以排除使用胎牛血清导致的异种成分引起的排斥现象。本专利技术，所述猪细胞中还可以加入选自如下至少一种的添加因子：表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、孕马血清促性腺激素(PMSG)。采用本专利技术所述的猪细胞培养基可以显著改善猪细胞的培养状态和提高猪细胞的增殖水平，有利于用猪的细胞进行转基因克隆和诱导性多能干细胞的相关研究和应用。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清，并且按照培养基的总体积，所述胎猪血清的含量为5％-25％(v/v)。在本专利技术的一个实施方案中，猪细胞培养基中所述胎猪血清的含量为8-12％(v/v)。在本专利技术的又一个实施方案中，猪细胞培养基中所述胎猪血清的含量为10-12％(v/v)。在本专利技术中，猪细胞是指来源于猪个体的各种部位不同生长时期的细胞。本专利技术的猪细胞培养基适用于来自猪个体不同生长时期的各种细胞，包括但不限于：原代猪成纤维细胞、猪肾细胞、猪心肌细胞、猪卵母细胞、猪血管内皮细胞等等。其中，所述“猪细胞”和“胎猪血清”中的猪的品系并不特别限定，常见的是家猪。所述胎猪血清可以按照如下方法制得：1)血清分离：将获自猪胎的血样进行离心，获得血清；2)冷冻脱纤：将步骤1)中离心分离得到的血清在-20℃下冷冻脱纤(即脱去纤维)；3)澄清过滤：将步骤2)中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进行过滤；4)血清透析：将步骤3)得到的样品用分子量12000-14000的透析膜在0.15M NaCl溶液中透析，直至样品的葡萄糖含量＜0.5mg/mL；5)γ射线照射：将步骤4)得到的样品进行γ射线照射，照射剂量为1.2-4Gy，得到粗制血清；和6)除菌过滤：先后使用0.2微米和0.1微米滤膜，将步骤5)中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。上述步骤1)中，所述猪胎优选3-4周龄的猪胎。在本专利技术的一个实施方案中，所述胎猪血清的制备方法还包括步骤7)和8)：7)紫外线照射：装瓶前用紫外线照射；8)封装保存：将前面步骤7)制得的胎猪血清装瓶密封，-20℃低温保存，使用之前4℃过夜解冻。在本专利技术的一个实施方案中，所述猪细胞培养基中的基础培养基为DMEM、或F12、或者是如下面的表1所示组成的人工培养基：表1：人工培养基配方  化合物名称  含量(mg/L)  无水氯化钙  200.00-240.00  L-丝氨酸  42.00-55.00  L-色氨酸  16.00-20.00  L-苏氨酸  95.00-110.00  L-酪氨酸钠盐  104.00-123.00  硝酸铁  0.10-0.40  氯化钾  400.00-600.00  L-缬氨酸  94.00-112.00  L-盐酸精氨酸  84.00-98.00  L-谷氨酰胺  584.00-628.00  L-盐酸胱氨酸  63.00-72.00  L-亮氨酸  95.00-110.00  L-异亮氨酸  93.00-105.00  L-盐酸组氨酸  32.00-52.00  L-盐酸赖氨酸  126.00-156.00  L-甲硫氨酸  25.00-40.00  L-苯丙氨酸  46.00-78.00  无水硫酸镁  87.67-99.60  氯化钠  4400.00-6700.00  无水磷酸二氢钠  105.00-145.00  D-泛酸钙  2.00-6.00  氯化胆碱  2.00-5.50  叶酸  3.00-5.50  肌醇  5.20-8.30  甘氨酸  20.00-40.00  烟酰胺  3.00-5.00  核黄素  0.20-0.60  盐酸硫胺  2.00-5.00  盐酸吡哆辛  3.00-6.00  葡萄糖  3500.00-5500.00  丙酮酸钠  100.00-120.00  酚红  14.00-16.00在本专利技术的一个实施方案中，所述猪细胞培养基还包括添加因子。在本专利技术中，术语“添加因子”是指选自如下的至少一种：1)表皮生长因子(EGF)，例如鼠表皮生长因子(如：Sigma E1257)；2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，例如牛碱性成纤维细胞生长因子(如Sigma F5392)；人绒毛膜促性腺激素(HCG)(如Sigma C0684)、以及孕马血清促性腺激素(PMSG)(如Sigma G4877)。在本专利技术的一个实施方案中，所述猪细胞培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清，并且按照猪细胞培养基的总体积，所述胎猪血清的含量为５％－２５％（ｖ／ｖ）；具体地，所述胎猪血清的含量为８％－１２％（ｖ／ｖ）；更具体地，所述胎猪血清的含量为１０％－１２％（ｖ／ｖ）。

【技术特征摘要】
1.一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清，并且按照
猪细胞培养基的总体积，所述胎猪血清的含量为5％-25％(v/v)；
具体地，所述胎猪血清的含量为8％-12％(v/v)；更具体地，所述胎猪
血清的含量为10％-12％(v/v)。
2.根据权利要求1所述的猪细胞培养基，其中，所述胎猪血清按
照如下方法制得：
1)血清分离：将获自猪胎的血样进行离心，获得血清；
2)冷冻脱纤：将步骤1)中离心分离得到的血清在-20℃下冷冻
脱纤；
3)澄清过滤：将步骤2)中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进
行过滤；
4)血清透析：将步骤3)得到的样品用分子量12000-14000的
透析膜在0.15M NaCl溶液中透析，直至样品的葡萄糖含量＜0.5
mg/mL；
5)γ射线照射：将步骤4)得到的样品进行γ射线照射，照射剂
量为1.2-4Gy，得到粗制血清；和
6)除菌过滤：先后使用0.2微米和0.1微米滤膜，将步骤5)
中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
3.根据权利要求1所述的猪细胞培养基，其中，所述基础培养基
为DMEM、或F12、或者是如下组成的人工培养基(mg/L)：
无水氯化钙      200.00-240.00
L-丝氨酸        42.00-55.00
L-色氨酸        16.00-20.00
L-苏氨酸        95.00-110.00
L-酪氨酸钠盐    104.00-123.00
硝酸铁            0.10-0.40
氯化钾            400.00-600.00
L-缬氨酸          94.00-112.00
L-盐酸精氨酸      84.00-98.00
L-谷氨酰胺        584.00-628.00
L-盐酸胱氨酸      63.00-72.00
L-亮氨酸          95.00-110.00
L-异亮氨酸        93.00-105.00
L-盐酸组氨酸      32.00-52.00
L-盐酸赖氨酸      126.00-156.00
L-甲硫氨酸        25.00-40.00
L-苯丙氨酸        46.00-78.00
无水硫酸镁        87.67-99.60
氯化钠            4400.00-6700.00
无水磷酸二氢钠    105.00-145.00
D-泛酸钙          2.00-6.00
氯化胆碱          2.00-5.50
叶酸              3.00-5.50
肌醇              5.20-8.30
甘氨酸           ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李巍，梁颜，刘欢，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大方舟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94