半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法，采用MEM基础培养基添加20％的胎牛血清、0.1％的β-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1ng/ml白血病抑制因子、1nmol的丙酮酸钠、1nmol的谷氨酰胺，配制成完全培养基，将组织块接种在培养瓶中，翻瓶倒置培养3h，待组织块贴壁后再正置培养瓶使组织块浸泡在培养基中培养。采用胰酶消化方法进行细胞的传代培养。采用上述方法建立半滑舌鳎精巢细胞系1个，已传代培养至第50代，同时本发明专利技术还提供了所构建细胞系的染色体和分子标记水平的鉴定方法，以及该细胞系对相关病毒敏感性的鉴定方法。本发明专利技术建立的半滑舌鳎精巢细胞系的构建方法可以应用于其它鱼类性腺细胞培养和细胞系建立，具有较为广泛的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物细胞培养技术，涉及一种半滑舌鳎性腺细胞培养和细胞系构建及鉴定的方法。
技术介绍
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方沿海经济海水鱼类，养殖年产值超过10亿元。但半滑舌鳎雌雄个体间存在明显的生长差异，雌鱼生长速度为雄鱼的2-4倍， 养殖产业上亟待解决雄鱼生长缓慢的瓶颈问题。在遗传上，半滑舌鳎雌鱼具有异型W染色体，属于WTL型性别决定类型，该性别决定类型在鱼类上较为罕见。解析半滑舌鳎性别决定机制不仅有助于揭示其雌雄生长差异的本质，而且可为鱼类性别控制研究提供理论基础。鉴于此，近年来在半滑舌鳎性别决定机制研究方面，已经筛选到7个雌性AFLP特异标记；1个微卫星雌性特异标记；克隆了 Dmrtl、Dmrt3、Dmrt4、Sox9、Dax, Fox2等性别相关基因，其中只有Dmrtl基因在半滑舌鳎雄性的精巢特异表达；半滑舌鳎全基因组测序的完成，为全面揭示性别和生长关系的分子机制提供了大量的遗传信息。然而，由于缺乏半滑舌鳎性腺来源的体外培养细胞系，极大的限制了对半滑舌鳎性别相关基因的功能研究、新的性别决定基因的发现、性别表达调控网络证实、性别基因间及性别基因与生长相关基因相互关系的揭示。迄今为止，虽然建立了半滑舌鳎胚胎细胞系、肝脏细胞系和心肌细胞系， 仍未见有关半滑舌鳎性腺细胞系的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是利用半滑舌鳎雄性精巢，提供一种半滑舌鳎精巢细胞系的构建方法，为研究性别相关基因的功能、作用机理及基因间的相互作用关系及转基因研究等提供基础研究平台，同时提供有关半滑舌鳎性腺细胞系的鉴定方法和半滑舌鳎性腺细胞系对相关病毒敏感性的鉴定方法。本专利技术通过以下技术方案解决半滑舌鳎精巢细胞系构建的问题，包括以下步骤 配制细胞完全培养基、精巢细胞原代培养和传代培养1)、配制细胞完全培养基将市售GIBCO标准MEM培养基溶解为1000ml，然后加入2. 38g Hepes缓冲剂，充分溶解、搅拌混勻后，调节pH在7. 2-7. 5，过滤灭菌后，作为基础培养基，4°C保存；使用前在基础培养基中加入占总体积15% -20%的胎牛血清、占总体积 0. 的β-巯基乙醇、2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、lng/ml白血病抑制因子、Inmol 的丙酮酸钠和Inmol的谷氨酰胺，配制成完全培养基；2)精巢细胞原代培养取体重为250g左右的2龄雄鱼精巢置于直径为3. 5cm的一次性无菌培养皿中，PBS冲洗一次，70%酒精浸泡;3min，PBS冲洗两次；将精巢组织剪成小于Imm3的小块，在小组织块上滴加1-2滴完全培养基，用无菌的200ul移液器吸头轻轻吸取组织块，接种在底面积为25cm2的培养瓶中，在培养瓶底均勻接种25-30个Imm3的小组织块，将培养瓶翻转，使底部朝上，加入完全培养基anl，倒置于23-25°C的培养箱中培养；池后，当组织块贴紧培养瓶壁时，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中；24h后补加完全培养基至細1，补加时避免将刚贴壁的组织块吹起；隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔5天更换完全培养基的2/3，每次更换时吸出脱壁的组织块；3)传代培养原代培养细胞开始增殖后，以组织块为中心形成细胞集落，各个组织块间的细胞集落相互接触相连，细胞数目增多，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以 0. 25%的胰酶溶液消化贴壁细胞，消化Ι-aiiin后吸出胰酶溶液，加入完全培养基；用Iml移液器轻轻吹打，使细胞悬浮，以一分为二的比例进行传代；根据细胞生长状态，3-5天传代一次。本专利技术还涉及一种上述方法构建的半滑舌鳎精巢细胞系的染色体鉴定方法，步骤如下将半滑舌鳎精巢细胞接种于25cm2的培养瓶中，24°C培养对_3他后，加入终浓度为0. lug/ml的秋水仙素，池后消化收集细胞，离心后的细胞沉淀以0. 075Mol的KCl溶液低渗处理30min，在低渗结束前5min，逐滴加入Iml预冷的卡诺固定液，其成份为甲醇乙酸 =3 1，预固定5min，离心后去上清，添加5ml的卡诺固定液继续固定30min ；离心，细胞重悬于0. 5ml的卡诺固定液中，4°C放置4h ；之后细胞悬液以冷滴法滴片，风干，10%吉姆萨染色30min，用Nikon显微镜观察并照相，统计100个以上细胞分裂相的染色体数目，并进行分析，选取80%以上的细胞分裂相中含有的染色体数目作为该细胞系的染色体数。本专利技术还涉及一种上述方法构建的半滑舌鳎精巢细胞系的分子标记鉴定方法，步骤如下采用半滑舌鳎雌性特异标记引物CseF382，引物序列为CseF382m 5，-ATTCACTGACCCCTGAGAGC-3，；CseF382Cl :5，-AACAACTCACACA CGACAAATG-3，对半滑舌鳎精巢细胞系进行鉴别，以半滑舌鳎雄鱼DNA、雌鱼DNA以及精巢细胞系DNA为模板，进行PCR 扩增，如果在精巢细胞系DNA中扩增出雌性特异条带，表明该细胞系来自于雌鱼；如果扩增不出雌性特异DNA条带，表明该细胞系来源于雄鱼。本专利技术还涉及一种上述方法构建的半滑舌鳎精巢细胞系对病毒敏感性的鉴定方法，步骤如下用分离出的牙鲆淋巴囊肿病毒(IXDV)悬液或大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)悬液分别感染半滑舌鳎精巢细胞系，将病毒悬液注入细胞培养基中作用lh，之后将含病毒的培养基吸出，更换新的培养基；感染后每隔1 观察细胞病变效应CPE，并对感染细胞进行固定和超薄切片，通过透射电镜观察细胞超薄切片中是否有病毒颗粒，从而判别细胞系对病毒的敏感性，如果病毒感染后，细胞出现明显的病变效应，并且感染细胞中含有病毒颗粒，则证明细胞系对病毒感染是敏感的，可以用于繁殖病毒。本专利技术的有益效果利用这种方法获得的半滑舌鳎精巢细胞系已传至55代。该细胞系主要特点是细胞系可以连续传代，生长速度快，传代频率高，能提供大量的半滑舌鳎精巢细胞；细胞系经细胞水平的染色体鉴定和分子水平的性别特异标记鉴定后，确定为半滑舌鳎精巢的正常二倍体细胞，并且对牙鲆淋巴囊肿病毒和大菱鲆虹彩病毒敏感，可以应用于病毒扩增、病毒特性研究、疫苗研制、性别相关基因功能研究等方面。用上述方法构建的半滑舌鳎精巢细胞系，最适生长温度为M°C，可以进行连续传代、扩增，也可以对其进行冷冻保存。染色体核型分析为TL型，染色体数为42条，从细胞水平鉴定其为雄性，排除了伪雄的可能。通过雌性特异的AFLP标记鉴定，未扩增出阳性片段， 确定所取半滑舌鳎性腺来自遗传雄性。以PEGFP-N3进行基因转染实验，观察到较强的绿色荧光，转染效率可高达50%，说明该方法构建的半滑舌鳎性腺细胞系可以直接应用于外源基因功能研究。病毒感染试验证明了该细胞系对于牙鲆淋巴囊肿病毒(LCDV)及大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)敏感，可用于对这两种病毒的扩增和分离，同时对于研究鱼类病毒和宿主细胞相互作用的机制具有重要意义。本专利技术所述的半滑舌鳎精巢细胞系的建立方法取材的雄性半滑舌鳎遗传背景清楚、选取的生长发育阶段恰当，可重复性强，染色体鉴定方法直观，分子标记鉴定方法准确可靠，摸索的精巢细胞完全培养基成分全面，能够完全适应细胞生长增殖，总结此方法对于构建其他鱼类的性腺组织来源的细胞系极具参考价值，对于研究鱼类性别决定机制本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种半滑舌鳎精巢细胞系的构建方法，其特征在于它的方法，包括：配制细胞完全培养基、精巢细胞原代培养和传代培养；１）、配制细胞完全培养基：将市售ＧＩＢＣＯ标准ＭＥＭ培养基溶解为１０００ｍｌ，然后加入２．３８ｇ　Ｈｅｐｅｓ缓冲剂，充分溶解、搅拌混匀后，调节ｐＨ在７．２－７．５，过滤灭菌后，作为基础培养基，４℃保存；使用前在基础培养基中加入占总体积１５％－２０％的胎牛血清、占总体积０．１％的β－巯基乙醇、２ｎｇ／ｍｌ人碱性成纤维细胞生长因子、１ｎｇ／ｍｌ白血病抑制因子、１ｎｍｏｌ的丙酮酸钠和１ｎｍｏｌ的谷氨酰胺，配制成完全培养基；２）精巢细胞原代培养：取体重为２５０ｇ左右的２龄雄鱼精巢置于直径为３．５ｃｍ的一次性无菌培养皿中，ＰＢＳ冲洗一次，７０％酒精浸泡３ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗两次；将精巢组织剪成小于１ｍｍ３的小块，在小组织块上滴加１－２滴完全培养基，用无菌的２００ｕｌ移液器吸头轻轻吸取组织块，接种在底面积为２５ｃｍ２的培养瓶中，在培养瓶底均匀接种２５－３０个１ｍｍ３的小组织块，将培养瓶翻转，使底部朝上，加入完全培养基２ｍｌ，倒置于２３－２５℃的培养箱中培养；３ｈ后，当组织块贴紧培养瓶壁时，轻轻翻转培养瓶，将培养瓶正置，轻晃培养瓶，使各组织块浸到培养液中；２４ｈ后补加完全培养基至４ｍｌ，补加时避免将刚贴壁的组织块吹起；隔天观察细胞贴壁及生长状态，每隔５天更换完全培养基的２／３，每次更换时吸出脱壁的组织块；３）传代培养：原代培养细胞开始增殖后，以组织块为中心形成细胞集落，各个组织块间的细胞集落相互接触相连，细胞数目增多，从而使整个瓶底细胞连成单层的一片，以０．２５％的胰酶溶液消化贴壁细胞，消化１－２ｍｉｎ后吸出胰酶溶液，加入完全培养基；用１ｍｌ移液器轻轻吹打，使细胞悬浮，以一分为二的比例进行传代；根据细胞生长状态，３－５天传代一次。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，张博，沙珍霞，王贤丽，王娜，杨长庚，刘珊珊，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95