猪体细胞的重组蛋白诱变方法技术

本发明专利技术公开了一种猪体细胞的重组蛋白诱变方法。其方法是构建细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白用于猪体细胞的诱导，从细菌中提取并纯化细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白，将限定因子重组蛋白添加到猪体细胞培养液中进行诱变，细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白能够进入猪体细胞中，在干细胞培养条件下能够逐渐形成集落边缘界限清晰的细胞集落，细胞集落中的单个细胞呈现圆形、细胞核较大且在细胞内所占比例较高，集落内细胞表达碱性磷酸酶和干细胞特异性分子标记Oct?4和Nanog。本发明专利技术证实限定因子重组蛋白能够使猪体细胞在形态、生长方式、基因表达等方面发生诱变作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞诱变
，尤其涉及一种。 诱变是现代生命科学研究的热点，诱导多能性干细胞是通过诱变作用诞生的人造新型干细胞。另外，通过诱变作用能够使普通机体细胞横向分化转变成神经细胞，这些诱变作用能够为人类的再生医学点燃了希望的火光，大量诱变形成的种子细胞能够有效治疗人类的癌症、退化性疾病等顽疾。另外，采用这种生物疗法能够有效避免大量化学药物的应用。随着科学技术的高速发展，重组蛋白将会成为细胞的诱变过程中的主力军。本专利技术要解决的技术问题是提供一种。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，一种，包括以下步骤(1)重组蛋白的制作使用的重组蛋白原核表达载体为pET-28a_EGFP，表达细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞；采用9个精氨酸的细胞穿透肽分别介导外源限定基因oct4、sox2, klf4和myc， 重组蛋白的基本组成形式为细胞穿透肽-外源限定因子_绿色荧光蛋白；将包含重组蛋白的原核表达载体转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，铺板、挑取单个菌落，在37°C摇床， 含卡那霉素的细菌培养基中振荡培养过夜，然后加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG进行诱导重组原核蛋白表达；诱导蛋白表达后收集菌体，重悬于冰浴预冷的结合缓冲液中，超声前加入终浓度为lmmol/L PMSF，冰上超声裂解细菌；裂解上清液经0. 45 μ m滤膜过滤后装入有His-Bind树脂的层析柱中，用漂洗缓冲液洗涤，洗脱缓冲液洗脱结合的重组蛋白，经 0.22 um滤膜过滤除菌，-20°C冻存备用；(2)重组蛋白的诱变当猪胎儿成纤维细胞生长汇合80%时传代，计数后将5X IO5个细胞接种于培养皿内，培养皿提前用0. 明胶包被；第2d分别等量同时加入所述的oct4、sox2, klf4和 myc限定因子的重组蛋白于猪胎儿成纤维细胞高糖DMEM培养液中，24h后更换为含4 μ g/ ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液，继续培养24h ；此过程为1个周期，如此重复 4-6个周期；4-6个周期后，将猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化后接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每个培养皿接种的细胞数约为1 X IO5,继续用含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液培养；以后每天观察细胞变化，2-3d换液1次，观察有无典型干细胞样细胞克隆出现。上述细胞穿透肽的9个氨基酸组成为精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸。蛋白在细胞的生长过程中发挥着重要的功能，细胞的生长、增殖或衰老均与蛋白的功能息息相关。由细胞穿透肽介导的外源蛋白进入细胞后能够调节细胞的生长和增殖， 从而发挥外源蛋白的生物学功能。目前介导外源基因表达的方式很多，病毒以稳定、高效介导外源基因而广泛应用。但是病毒介导的外源基因在细胞内表达存在表达外源基因的细胞易出现癌化畸变现象。细胞穿透肽作为一种新型的多肽是由9或11个氨基酸残基组成的， 类似于细胞内天然的多肽产物，对于进入任何细胞均具有无毒和无副作用。另外，细胞穿透肽可携带外源生物大分子进入活细胞，且不影响所携带蛋白质的生物学活性，同时不受细胞类型的影响，其介导作用具有速度快，不依赖于温度、能量、细胞膜抗体，及对细胞没有损伤等特点，细胞穿透肽这种具有穿越细胞膜的独特功能，从而介导外源蛋白发挥生物学功能。本专利技术的有益效果是有效避免了病毒在转基因过程中由于外源基因的随机稳定整合而带来潜在的细胞癌化畸变危害，利用蛋白具有无毒无副作用的特点，通过构建9个精氨酸的细胞穿透肽携带外源蛋白和绿色荧光蛋白共同组成重组蛋白，借助大肠杆菌能够在短时间内高效生产出大量限定因子的重组蛋白。从大肠杆菌中提取并纯化细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白，将限定因子重组蛋白添加到猪胎儿成纤维细胞培养液中进行诱变，细胞穿透肽携带外源限定因子的重组蛋白能够进入猪胎儿成纤维细胞中，在干细胞培养条件下能够逐渐分离培养出集落边缘界限清晰的细胞集落，细胞集落中的单个细胞呈现细胞核较大，在细胞内所占比例较高，集落内细胞表达碱性磷酸酶，干细胞特异性分子标记0ct4和Nanog蛋白表达为阳性。本专利技术证实利用人工生产的限定因子重组蛋白能够使猪胎儿成纤维细胞在形态、生长方式、基因表达等方面发生诱变作用。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明图1是本专利技术实施例猪胎儿成纤维细胞的细胞形态。图2是本专利技术实施例猪胎儿成纤维细胞重组蛋白作用后形成干细胞集落的形态 (右图为左图方框处的高倍镜放大图)。1材料与方法1.1主要实验材料重组蛋白的表达细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞；细胞穿透肽的9个氨基酸组成为精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸；重组蛋白原核表达载体的基本重组结构为pET-28a_细胞穿透肽-外源限定因子-绿色荧光蛋白； 细胞培养液为高糖DMEM培养液；1. 2主要操作方法1.2. 1重组蛋白的制作使用的重组蛋白原核表达载体为pET-28a_EGFP，表达细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞。细胞穿透肽的氨基酸组成为精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸，采用9个精氨酸的细胞穿透肽分别介导外源限定因子 oct4、sox2、klf4和myc，构建的重组蛋白基本组成形式为细胞穿透肽-外源限定因子_绿色荧光蛋白。将包含重组蛋白的原核表达载体转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，铺板、挑取单个菌落，在37°C摇床，含卡那霉素的细菌培养基中振荡培养过夜，然后加入终浓度为 0. lmmol/L的IPTG进行诱导重组原核蛋白表达，在22°C诱导表达时间为3h。诱导蛋白表达后，12000rpm离心IOmin收集菌体，重悬于冰浴预冷的结合缓冲液中，超声前加入终浓度为 lmmol/L PMSF，冰上超声裂解细菌。裂解上清液经0. 45 μ m滤膜过滤后装入有His-Bind树脂的层析柱中，用漂洗缓冲液洗涤，洗脱缓冲液洗脱结合的重组蛋白，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌，-20°C冻存备用。1.2. 2重组蛋白的诱变当猪胎儿成纤维细胞生长汇合80%时传代，计数后将5 X IO5个细胞接种于60mm 培养皿内，60mm皿提前15min用0. 明胶包被。第2d分别同时等量加入oct4、sox2、klf4 和myc四种限定因子的重组蛋白于高糖DMEM培养液中，每种限定因子重组蛋白的浓度为 10 μ g/ml，24h后更换为含4 μ g/ml bFGF和10U/mlLIF的高糖DMEM培养液，继续培养24h。 24h后分别同时等量加入OCt4、SOX2、klf4和myc四种限定因子的重组蛋白于培养液中，此操作过程为1个诱变处理周期，如此重复操作4-6个诱变处理周期。在4-6个诱变处理周期后，将猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化后接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每个60mm 皿接种的细胞数约为1 X IO5,继续用含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液培养。以后每天观察细胞变化，2-3d换液1次，观察有无典型干细胞样细胞克隆出现。1. 2. 3诱变细胞的鉴定诱变细胞经4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30分钟，添加一抗为兔本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪体细胞的重组蛋白诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）重组蛋白的制作使用的重组蛋白原核表达载体为ｐＥＴ－２８ａ－ＥＧＦＰ，表达细胞为ＢＬ２１大肠杆菌感受态细胞；采用９个精氨酸的细胞穿透肽分别介导外源限定基因ｏｃｔ４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４和ｍｙｃ，重组蛋白的基本组成形式为细胞穿透肽－外源限定因子－绿色荧光蛋白；将包含重组蛋白的原核表达载体转化入大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞，铺板、挑取单个菌落，在３７℃摇床，含卡那霉素的细菌培养基中振荡培养过夜，然后加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导重组原核蛋白表达；诱导蛋白表达后收集菌体，重悬于冰浴预冷的结合缓冲液中，超声前加入终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，冰上超声裂解细菌；裂解上清液经０．４５μｍ滤膜过滤后装入有Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ树脂的层析柱中，用漂洗缓冲液洗涤，洗脱缓冲液洗脱结合的重组蛋白，经０．２２μｍ滤膜过滤除菌，－２０℃冻存备用；（２）重组蛋白的诱变当猪胎儿成纤维细胞生长汇合８０％时进行传代，计数后将５×１０５个细胞接种于培养皿内，培养皿提前用０．１％明胶包被；第２ｄ等量同时加入所述的ｏｃｔ４、ｓｏｘ２、ｋｌｆ４和ｍｙｃ限定因子的重组蛋白于猪胎儿成纤维细胞高糖ＤＭＥＭ培养液中，２４ｈ后更换为含４μｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ和１０Ｕ／ｍｌ　ＬＩＦ的高糖ＤＭＥＭ培养液，继续培养２４ｈ；此过程为１个周期，如此重复４－６个周期；４－６个周期后，将猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每个培养皿接种的细胞数约为１×１０５，继续用含４μｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ和１０Ｕ／ｍｌ　ＬＩＦ的高糖ＤＭＥＭ培养液培养；以后每天观察细胞变化，２－３ｄ换液１次，观察有无典型干细胞样克隆出现。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿国，殷慧群，章孝荣，孙雪萍，杨盼，蒲勇，张运海，刘亚，陶勇，方富贵，李运生，任春环，张子军，丁建平，刘洪瑜，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34