本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其发酵生产丁二酸的方法。本发明专利技术通过分子生物学手段改造大肠杆菌的ATP生物合成途径，过量表达与该途径有关的酶的活性，有效的提高了大肠杆菌胞内ATP的总量，使重组大肠杆菌能够利用木糖代谢生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及。
技术介绍
丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBQ类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来 12种最有价值的生物炼制产品之一。丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2,能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Armerobiospirillum succiniciproducens^Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、 重组谷氨酸棒杆菌和重组五Coli0利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。 E. coli由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。E. coli野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以减少副产物的生成。但是，由于敲除了 PFL基因，导致菌株不能生产乙酸，从而使伴随乙酸生成的ATP减少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长，并且生产丁二酸。玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此大肠杆菌Nzmii不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比1 5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250 380 μ m, H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126°C，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) 2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸秆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用， 绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121°C处理稻草秸秆1 h，再用20 g/L的NaOH于121°C处理秸秆1 h，葡萄糖和木糖二者总质量浓度都达50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此不能利用木糖的大肠杆菌菌株不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在feciBm subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达五COli /7/7C和/7Ci，研究发现过量表达/7/7C可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3. 5倍，而过量表达对发酵结果没有影响，但在/7/7C缺陷菌株中，/X^的过量表达能够提高琥珀酸的产量。
技术实现思路
本专利技术的技术目的在于提供了一种基于ATP生物合成系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低了生产成本，提高经济效益。为实现本专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案。，其特征在于包括如下步骤(1)以缺乏乳酸脱氢酶基因Qi/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五C^i NzmiI菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏 IdhA,pfIB和PPC的感受态菌株；(2)单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(Pd)基因，以及选择自苹果酸酶Cs/d)基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶Oy^)基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；(3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(1)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；(4)利用步骤(3)的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。具体的，利用本专利技术所述的上述方法可以细分为下述几个具体方法。Α、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌Escherichia coli BA204 以缺乏乳酸脱氢酶基因UdhA \丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7i )活性的五coli NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；合成一对5，端带有酶切位点的引物，以Bacillus subtilis基因组DNA为模板，纯化扩增出的Pd基因后，表达质粒pTrC99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、 连接获得重组质粒pTrC99a-/7d ；将质粒pTrC99a-/7d导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受态，获得的阳性转化子即为 Escherichia coli BA204 ；利用federicAia coli BA204过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力。B、过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌fecAericAia coli BA205 以缺乏乳酸脱氢酶基因(7^/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五coli NZNlll 菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同时缺乏MhA、pflB 和PPC的感受态菌株；合成一对5’端带有相同酶切位点的引物，以feciBm subtilis基因组DNA为模板， 纯化扩增出的pci基因后，已构建的重组质粒pTrcgga-s/d用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTr￠:99^1-5/^-/74 ；将质粒导入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用木糖代谢产丁二酸大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（１）以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大肠杆菌菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ和ＰＰＣ的感受态菌株；（２） 单独纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及选择自苹果酸酶基因、苹果酸脱氢酶基因或丙酮酸羧化酶基因这三种基因中的一种，构建得到单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种的表达质粒；（３）将步骤（２）所述的质粒导入步骤（１）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；（４）利用步骤（３）的阳性转化子单独过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及选择自苹果酸酶、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶这三种酶中的一种，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，刘嵘明，梁丽亚，马江锋，陈可泉，韦萍，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84
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