构建严谨型T7表达系统宿主菌的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种构建严谨型T7表达系统宿主菌的方法。利用内含肽反式剪接构建严谨型T7表达系统宿主菌，将T7RNA聚合酶分解为氨基末端即N端聚合酶与羧基末端即C端聚合酶，选择一个内含肽I，将内含肽I也分解为氨基末端即N端与羧基末端即C端的内含肽I；将这两个氨基末端的聚合酶与内含肽I融合，在这个基因上游融合常用启动子及其控制基因；同样的，将这两个羧基末端的聚合酶与内含肽I融合融合，在这个基因上游融合一个常用启动子及其控制基因；将这两个融合部分插入大肠杆菌的染色体或低拷贝数质粒中，就得到了严谨型T7表达系统宿主菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种诱导物严谨控制的大肠杆菌中基因表达系统的方法，更明确的是，本专利技术是一种以两个诱导物共同控制T7表达系统宿主菌的方法，以达到有效生产重组蛋白的目的。
技术介绍
大肠杆菌T7表达系统通过基因工程途径，以生物为反应器来生产重组蛋白是一项极为重要的生物技术产业。可以用作生物反应器的生物细胞包括微生物、昆虫、动物和植物细胞等，其中又以大肠杆菌最具竞争力。原因在于，大肠杆菌具有生物学背景清楚、容易大量培养、生长快速、培养成本低廉等特点。启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。Studier 和 Moffat 于 1986 年(Studier and Moffatt, J Mol Biol, 1986;Studier et al.，US patent 4952496，1990)建立了一套新的原核表达系统-T7 RNA聚合酶/启动子表达系统(简称T7表达系统)，现在由Novagen公司商业化，即pET载体系统。T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase)是由T7噬菌体基因1 (T7 gene 1)编码的。它能严格、特异地识别并驱动T7启动子(T7 promoter),高效转录mRNA。T7表达系统主要由两部分组成1) 一个大肠杆菌重组菌种，它的染色体上含有一个以hci/防启动子控制的T7基因1，例如菌株BL21(DE3) ；2) —个含有T7启动子的基因表达质粒，例如pET-30a(+)。目的基因被克隆到质粒载体上，受噬菌体T7强转录信号控制； 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。T7 RNA聚合酶十分有效并具选择性充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。该方法存在的主要缺陷是，在诱导表达之前，细胞中也会有少量T7 RNA聚合酶表达，由于T7 RNA聚合酶活性极强，即便是在未诱导细胞中少量存在，也可能使质粒对宿主菌产生毒性作用，表现为细菌发生溶解，容易死亡和不能形成单菌落等。所以，如何降低T7 RNA聚合酶的本底表达水平，以增强宿主菌对含T7启动子及目的基因的重组质粒的耐受性，是完善T7表达系统的关键。目前，常用的有三种方法来完善T7表达系统，以达到降低本底表达水平之目的 DStudier报道，在宿主细胞中适量表达T7溶菌酶(产物是天然的T7 RNA聚合酶抑制剂)，能提高细菌对T7启动子控制的外源基因的耐受能力，提高目的蛋白的表达量。这一方法，形成了 PLysS和pLysE宿主菌。其缺点是溶菌酶的过量表达，会影响细菌的正常生长。2)通过Lac阻抑物阻断T启动子控制的外源基因转录。例如，将Lac操纵基因插入表达质粒上的T7启动子附近不同位置，形成改造过的T7启动子，通常称为T71ac启动子。结果表明，如果存在足量的Lac阻抑蛋白，能很有效地抑制T7启动于转录。为了维持菌体内有足量Lac阻遏蛋白，可在T7启动子上游克隆阻遏蛋白的编码基因IacI。这一方法较为有效，是现在通常采用的策略。但它的严谨性仍有不足，即使与PLysS宿主菌联用， 仍有少量T7 RNA聚合酶泄露。这是由于Iac启动子的负调控本质所决定的。对于典型的负调控启动子，诱导/抑制比率约为50倍。也就是说，在抑制状态下(即本底水平)，T7 RNA 聚合酶的含量是诱导水平的2%。3)用其它更为严谨的启动子，例如阿拉伯糖诱导的arai^々启动子，来控制Τ7基因 1的表达。有两种策略，一是将受areiBAD启动子调控的T7基因1克隆到质粒上，与含目的基因的载体共转化(Wycuff and Mattews, Anal Biochem, 2000);二是将受^作拟汐启动子调控的T7基因1整合到大肠杆菌染色体上(赵云鹏等，国家专利技术专利，申请号02155709. 8)。 除了 ara^i 启动子之外，还有使用rAa^i 启动子的例子(Kebeler et al. US patent, 20060014291, 2006)。正调控的ara^i 启动子的诱导/抑制比率约为500倍。鼠李糖诱导的rAa拟々启动子因为是二级正调控的，它的诱导/抑制比率约为12000倍。这种使用正调控启动子的策略大大降低了 T7 RNA聚合酶的本底表达水平。但是人们对于表达系统的严谨性的要求是无止境的。这也是本专利技术提出极端严谨型T7表达系统宿主菌的目的。2、内含肽介导的反式剪接原理蛋白质内含肽(intein)是寄生在其它蛋白质中的一段多肽链。其编码DNA序列与正常蛋白的外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链。然后从中切除与内含肽对应的序列，再把被寄生蛋白质的序列连接起来，成为有功能的蛋白质。这是一种蛋白质的自我剪接机制。一般来说，蛋白质内含肽有10个模体(motif)，顺序依次为N，- AN2BN4CDEHFG - C，，其中A、 N2、B、N4、F、G属于自我剪接域的模体，而C、D、E、H属于归位核酸内切酶域的模体(Perler， Olsen and Adam, Nucleic Acids Res, 1997; Perler, Nucleic Acids Res, 2002)。对于内含肽行使剪接功能来说，归位核酸内切酶结构域并不是必须的。蓝藻Synechocystis sp. PCC6803 的 DNA聚合酶 III 的 α 亚基(DnaE)，分成两段， dnaE-n基因编码前774个氨基酸，dnaE-c基因编码后423个氨基酸，这两段间隔745kb。它们分别表达后，通过内含肽的相互识别，反式剪接到一起形成完整功能蛋白(Sim W, Yang J, Liu XQ. J Biol Chem, 2004)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的构建极端严谨型T7表达系统宿主菌的方法，该方法采用内含肽反式剪接技术，将T7 RNA聚合酶分解为两部分，分别置于两个不同的启动子控制之下。可以解决由于T7 RNA聚合酶本底表达导致的宿主菌对重组质粒的耐受性差，外源基因表达效率低等问题。本专利技术的技术方案是构建严谨型T7表达系统宿主菌的方法，利用内含肽反式剪接，构建严谨型T7表达系统宿主菌，将T7 RNA聚合酶(T7RNAP)分解为氨基末端(N端)聚合酶与羧基末端(C端)聚合酶，选择一个内含肽I (如蓝藻Synechocystis sp. PCC6803的DnaE)，将内含肽I也分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)的内含肽I ；将这两个氨基末端的聚合酶与内含肽I融合，在这个基因上游融合常用启动子及其控制基因；同样的，将这两个羧基末端的聚合酶与内含肽I融合融合，在这个基因上游融合一个常用启动子及其控制基因；将这两个融合部分插入大肠杆菌的染色体或低拷贝数质粒中，就得到了严谨型 T7表达系统宿主菌。本专利技术的有益效果是，本专利技术提出了一种利用内含肽反式剪接，构建极端严谨型 T7表达系统宿主菌的方法，拥有如下的优点1)使用两个启动子分别控制一半的T7聚合酶的表达，任何一个启动子泄露，都不会造成整个表达系统的泄露，严谨性约是本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．构建严谨型Ｔ７表达系统宿主菌的方法，利用内含肽反式剪接，构建严谨型Ｔ７表达系统宿主菌，其特征是将Ｔ７　ＲＮＡ聚合酶分解为氨基末端即Ｎ端聚合酶与羧基末端即Ｃ端聚合酶，选择一个内含肽Ｉ，将内含肽Ｉ也分解为氨基末端即Ｎ端与羧基末端即Ｃ端的内含肽Ｉ；将这两个氨基末端的聚合酶与内含肽Ｉ融合，在这个基因上游融合常用启动子及其控制基因；同样的，将这两个羧基末端的聚合酶与内含肽Ｉ融合融合，在这个基因上游融合一个常用启动子及其控制基因；将这两个融合部分插入大肠杆菌的染色体或低拷贝数质粒中，就得到了严谨型Ｔ７表达系统宿主菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建群，丁静，张莹，王强，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84