本发明专利技术公开了一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。该质粒含有４个木糖代谢相关的酶基因，木糖异构酶（ｘｙｌＡ）、木酮糖激酶（ｘｙｌＢ）、转醛酶（ｔａｌＡ）和转酮糖酶（ｔｋｔＡ），均来源于Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株。该质粒的构建方法是利用Ｇａｔｅｗａｙ技术，分别设计ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔａｌＡ和ｔｋｔＡ四种目的基因的特异性引物，以Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α为目的基因的来源菌株，通过ＰＣＲ扩增相应基因；ＰＣＲ产物与其对应的ｐＤＯＮＲ载体进行ＢＰ重组，获得的入门克隆（Ｅｎｔｒｙ ｃｌｏｎｅｓ）与ｐＤＥＳＴ１４进行ＬＲ重组，得到ｐＤＥＳＴ１４－ＡＢＡＴ质粒；ｐＤＥＳＴ１４－ＡＢＡＴ质粒用Ｘｂａ Ｉ和Ｎｈｅ Ｉ双酶切的产物ＡＢＡＴ与Ｘｈａ Ｉ单酶切的载体ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２进行连接，得到重组质粒ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２－ＡＢＡＴ。转入该质粒的优良菌种可大大降低纤维素乙醇的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于质粒构建领域，具体涉及一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，及该质 粒的构建方法。
技术介绍
随着石油资源的不断消耗，世界范围内的邮价迅速飙升，此外化石能源的大量使用对环 境造成了严重的影响。世界各国都投入大量的人力、财力和物力进行町再生生物质能源的开 发。其屮，乙醇由于可以利用多种可再生原料生产而且对环境几乎没有污染，成为最有前景 的石油替代能源之一。乙醇可以以淀粉、含糖的经济作物作为原料，也可以以木质纤维素类 生物质作为原料通过微生物发酵进行生产。木质纤维素原料是地球上产量最大，成本最低的 原料，是生产乙醇的最理想原料，纤维素乙醇具有非常广阔的发展前景。木质纤维素原料经 过化学或生物的方法可以水解为单糖，其水解物的主要成分是葡萄糖，其次是木糖，再次是 阿拉伯糖，还有很少量的其它糖类。自然界中能发酵生产乙醇的微生物大多数都只能利用木 质纤维素水解物中的葡萄糖，不能利用其中的戊糖，如木糖和阿拉伯糖。因此对原料的利用 率不高，造成纤维素乙醇的生产成本偏高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带木糖代谢相关基因的/'宿主质粒及它的构建方法，为培 育能利用木质纤维素水解物中的木糖发酵生产乙醇的优良茼种做了必要的准备工作。本专利技术提供的一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因， 其特征在于该质粒的序列如SEQ ID NO:l所示，以大肠杆菌DH5 a为载体菌，转化重组质粒 pBBRlMCS2-ABAT的大肠杆菌DH5 a ，分类命名为大肠埃希氏菌Ajcfe/7'c/z/fl co仏已于2008年 11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏登记号为 CGMCC NO. 2739。所述四个木糖代谢相关基因为木糖异构酶基因xyL4、木酮糖激酶基因x;;/S、转醛酶基因 to^4和转酮糖酶基因汰"，均来源于￡ co/z'DH5 a菌株。一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒的构建方法，其特征在于包括如下操作步骤(1) 分别设计砂"、矽W、 to"和汰"四种目的基因的特异性引物，以￡. DH5a为目的 基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；(2) 步骤(1)中得到的4种PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，得到4个目 的基因的入门克隆；(3) 4个目的基因的入门克隆与pDEST14进行LR重组，最终得到pDEST14-ABAT质粒；(4) J6a I和顺e I双酶切pDEST14-ABAT质粒的产物ABAT与ife I单酶切的载体pBBRlMCS2连接，经转化、筛选、酶切鉴定、测序后，得到重组质粒pBBRlMCS2-ABAT。 所述步骤(1)中的四种目的基因扩增所用引物分别为(1) 扩增xylA基因所用引物 上游引物CAGTGTGAA-3' (SEQ ID No: 2)下游引物-3' (SEQ ID No: 3)(2) 扩增xyB基因所用引物 上游引物G-3， (SEQ ID No: 4 ) 下游引物ACCAGC-3' (SEQ ID No: 5 )(3) 扩增talA基因所用引物 上游引物TCCAA-3' (SEQ ID No: 6 )下游引物(SEQ ID No: 7 )(4)扩增tktA基因所用引物 上游引物TC-3' (SEQ ID No: 8) 下游引物ATGCA-3， (SEQ ID No: 9 )所述步骤(4)中测序引物为Seq TCA1: 5，-TTAACGCTTACAATTTCC-3' (SEQ ID No: 10 ) Seq TCA2: 5'-ACACGCCTTATCTATTGC隱3， ( SEQ ID No: 11 ) Seq TCA3: 5'-TGGGTGTAAACCATCACC陽3' (SEQ ID No: 12 ) Seq TCA4: 5'-TCATGACCGTCGATGTCG-3' (SEQ ID No: 13 ) Seq TCA5: 5，-TAACGACTTGACGACAGC-3， (SEQ ID No: 14 ) SeqTCA6: 5'-AACAGCAGCGTCAGGTTG-3' (SEQ ID No: 15 ) SeqTCA7: 5，-CATTACGAGTAACCAACG-3， (SEQ ID No: 16) SeqTCA8: 5，-CTTGCTTAAGAACCCTTC-3, (SEQ ID No: 17 ) SeqTCA9: 5，-AGGTGCCAAGATCTATCC-3， (SEQ ID No: 18 ) SeqTCA10: 5，-ATAAGCAACGTGCCCTGG-3' (SEQ ID No: 19 )所述步骤(4)中ABAT与载体pBBRlMCS2连接为正向连接或反向连接。本专利技术的特点利用Gateway克隆技术进行4个木糖代谢相关酶基因的克隆构建，可以 大大縮短实验周期。将该质粒转入产乙醇的微生物菌种有望能高效利用木糖生产乙醇，降低 纤维素乙醇的生产成本。 附图说明图1为pDEST14-ABAT质粒构建的流程图2为入门克隆环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱；A:质粒电泳图谱1: pENTRY221-Ll-xylA-R5 (4066bp), 2: pENTRY221-L5-xy旧-L4(4253bp), 3: pENTRY221-R4-talA-R3(3887bp), 4: pENTRY221-L3-tktA-L2(4877bp)M: DNA分子量标记 B:质粒WteI酶切电泳图谱5: pENTRY221-Ll-xylA-R5 ( 3800+266bp), 6: pENTRY221-L5-xylB-L4(3987+266bp), 7: pENTRY221-R4-talA-R3 (3621+266bp)，8: pENTRY221誦L3-tktA-L2(461 l+266bp)， M: DNA分子量标记 图3为入门克隆质粒结构A: pENTRY221-Ll-xylA-R5， B: pENTRY221-L5-xy旧-L4， C: pENTRY221-R4-talA-R3 D: pENTRY221-L3-tktA-L2图4为pDEST14-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱； A: pDEST14-ABAT质粒及该质粒3g/ II酶切电泳图谱 1: pDEST14-ABAT质粒(11381bp)，2: pDEST14-ABAT质粒用Bg/II单酶切(1651+2757+6973bp)M: DNA分子量标记 B: pDEST14-ABAT质粒I酶切电泳图谱3: pDEST14-ABAT质粒用A^e I单酶切(11381bp)M: DNA分子量标记 图5为pDEST14-ABAT质粒结构图； 图6为pBBRlMCS2质粒结构图7为pBBRlMCS2-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱； 1: pBBRlMCS2-ABAT质粒用《/w I单酶切(5484+6756bp) 2: pBBRlMCS2 -ABAT质粒用￡coR I单酶切(1924+3866+6450bp) 3: pBBRlMCS2-ABAT质粒用&oRV单酶切(2836+4149+5255bp) 图8为p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因，其特征在于该质粒的序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李十中，郑焕娣，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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