携带人胸腺素β4基因的重组质粒制造技术

本发明专利技术涉及基因治疗领域，具体的说，就是以人胸腺素β４基因插入到一真核表达启动子下，构建成的一种重组质粒。该质粒能进入横纹肌细胞，且在细胞内利用细胞本身的蛋白合成系统，合成Ｔβ４，且分泌到胞外，从而加速伤口的愈合，以及阻止细胞的死亡，可用于皮肤、心脏损伤的修复。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因治疗领域，具体的说，就是以人胸腺素β4基因插入到一真核表达启动子下，构建成的一种重组质粒。该质粒能进入横纹肌细胞，且在细胞内利用细胞本身的蛋白合成系统，合成Tβ4，且分泌到胞外，从而加速伤口的愈合，以及阻止细胞的死亡。二.
技术介绍
免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中胸腺素β4(Tβ4)是现已结构和功能较为明确的一种主要的胸腺因子。正如用Tβ4(一种涉及正在发育的胚胎中细胞迁移和存活的蛋白)的活性所做的一项研究所表明的那样，“胸腺素-贝塔4”增强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活Akt“存活激酶”。这些结果说明，“胸腺素-贝塔4”对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治疗目标。德克萨斯州大学的研究人员发现一种在心脏发育过程中制造的蛋白质(胸腺素β-4)在心脏病发作后能够帮助心脏器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。胸腺素β-4是一种胚胎在心脏发育过程中表达的蛋白，它能促进心脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡。新研究表明这种蛋白能够在实验诱导的心脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。胸腺素β-4已经被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将来这种蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。Tβ4是Goldstein等最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽，含43个氨基酸，分子量4.963KD，无二硫键与糖基化。目前，临床上使用的Tβ4主要是来源于化学合成或基因重组得到的蛋白形式。由于Tβ4蛋白形式在体内的半衰期很短，这就使得临床病人必须在一定时间段内多次使用Tβ4。所以只需一到两次使用，就可在体内一段时间内表达Tβ4对受损组织起作用的基因治疗类Tβ4药物将会大大降低各项成本。但目前用于携带Tβ4作为基因治疗的载体主要有腺病毒载体(AV)、腺相关病毒载体(AAV)，在这两种载体中，AAV使用较多，主要是由于它们的病毒特性，使得转染率很高，易于携带基因进入人体细胞，然而正是由于它们的病毒特性，使得基因治疗的安全性成为倍受关注的问题。与AV与AAV相比，重组质粒由于其无生命形式，除非进入细胞，否则很快消失，使得基因治疗的安全性大大提高。三.
技术实现思路
本专利技术首先是提供一种利用裸质粒作为载体，运输Tβ4基因到细胞内去合成、分泌Tβ4蛋白，并通过此蛋白对周围组织中受损细胞起作用，阻止细胞死亡的重组裸质粒基因治疗用Tβ4，尤其是针对冠心病、顽固性皮肤溃疡等疾病。目前的研究已证明Tβ4是一种在人体组织受损时起重要作用的蛋白，它能刺激表面细胞与角质细胞的迁移，调节层粘连蛋白的表达，以及刺激血管的生成，甚至于阻止细胞的死亡，所以，人们已经开始把Tβ4用于临床，比如美国的RegenRx公司就用Tβ4治疗表皮受伤的病人，现在更发现Tβ4在心脏病上的效果也很好，但以上所述的临床治疗时都是使用的Tβ4的蛋白形式，这种方式是目前疾病治疗的常用方式，但是它的缺点是Tβ4蛋白在体内的半衰期短，病人要在一段时间内多次用药，这就大大增加了病人的治疗成本，要解决这个问题，本专利技术想到了基因治疗，基因治疗中最简单有效的方法，就是选择病毒载体来携带Tβ4进入细胞并表达蛋白，但正是由于病毒载体的特性，使得此种方法的安全性成为了很大的问题，特别是怕载体进入生殖细胞、干细胞等重要细胞。选用质粒载体目前大家都认为安全性比较高，但是它进入细胞很困难，人们常常得选用病毒外壳、基因枪、脂质体等外部条件协助质粒进入细胞。这就使得操作复杂，且目的蛋白的表达效果不理想，本专利技术构建出一种带有Tβ4基因的质粒载体，该重组质粒载体是裸质粒载体，不含病毒外壳与脂质体，在使用时也不使用基因枪，仅把质粒注射到病灶部位的肌肉内即可产生Tβ4蛋白并对受损组织起作用。本专利技术其次是提供一种重组质粒载体pNL-Tβ4，该质粒的第一个特征是含有Tβ4全长氨基酸序列对应的核酸序列；第二个特征是该质粒含有大肠杆菌内的自我复制区ColEI序列，人巨细胞病毒启动子p(CMV)序列，卡那霉素抗性基因序列，牛生长激素基因的polyA信号转录终止序列；第三个特征是该质粒具备上述两个特征后，大小没有超过4kb，使得pNL-Tβ4能利用横纹肌细胞的细胞表面的沟回结构进入肌细胞，再利用蛋白表达系统合成Tβ4，分泌到胞外对周围组织的受损细胞起作用。在实验研究中，发现注射了pNL-Tβ4的心肌肉组织中一个月内持续分泌Tβ4，而Tβ4与其它两种蛋白一起，通过激活Akt/蛋白激酶B来促进心肌细胞的迁移和存活。在研究了培养的细胞活性后，本专利技术将20只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从而创造出大鼠模型。接着给10只大鼠局部注射胸腺素Tβ4 250ug/只，给10只大鼠局部注射盐水200uL作为空白对照。注射pNL-Tβ4的大鼠一月后受损心脏中的细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能。而对照组大鼠受损心脏的细胞大量死亡。试验结果表明质粒pNL-Tβ4进入肌细胞，并使肌细胞分泌出Tβ4，Tβ4能够改变细胞的代谢并创造出更强大的心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。如果这种蛋白对人类同样有效，那么这种蛋白将会成为一种强有力的心脏病治疗药物。四.附图说明图1是pNL-Tβ4的结构图谱。图2是pNL-Tβ4的纯化后的Agarose纯度电泳图谱。图3是对大鼠模型注射pNL-Tβ4后，对大鼠心脏壁厚度的影响结果。图4是对大鼠模型注射pNL-Tβ4后，对大鼠心脏壁纤维化程度的影响结果。图5是对小鼠模型注射pNL-Tβ4后，Tβ4蛋白在体内的表达情况。五.具体实施例方式以下实例仅是为了对本专利技术的说明，而不会对本专利技术造成任何的限制。一)、裸质粒pNL-Tβ4的构建首先通过全基因合成扩增出胸腺素β4的全基因序列GCT AGC ATG TCT GGT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GATAAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCCAAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG目的片段经NdeI、XhoI双酶切后分别回收小片段，质粒pNL经XhoI和EcoR I双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为pNL-Tβ4(具体结构见图1)。然后用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD600为1.5时离心收集菌体，用碱裂解法提取质粒，经1％Agarose电泳鉴定，表达量大于1mg质粒/克菌体。经NdeI、XhoI双酶切检定，切出150bp片断。所获得的的工程菌命名为pNL-Tβ4/DH5a。二)、裸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类通过质粒载体介导的基因治疗载体组合物，特征为：该质粒能进入横纹肌细胞，且在肌细胞内合成、分泌人胸腺素β４；合成的胸腺素β４氨基酸序列为：Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｐｈ ｅ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马素永，聂李亚，许松山，文美玉，
申请(专利权)人：北京诺思兰德生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]