本发明专利技术公开了一种HPV58型E6/E7融合基因，该融合基因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。本发明专利技术还公开了应用该融合基因制备的治疗性复合基因疫苗，该疫苗以上述融合基因为靶抗原，以人白介素12(hIL12)作为抗原佐剂。本发明专利技术提供的融合基因和治疗性复合基因疫苗安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想，为治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变提供了更好的选择，尤其适合HPV58型高感染的中国和亚洲宫颈癌患者。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及宫颈癌防治领域，尤其是人乳头瘤病毒58型(以下简称HPV58型)E6/ E7融合基因及治疗性复合基因疫苗。
技术介绍
子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。我国每年有新发病例约13. 15万，占世界宫颈癌新发病例总数的观.8%，每年死于宫颈癌的患者约5万人，大部分位于经济欠发达的西部地区如广西。目前，晚期宫颈癌患者采用外科手术、放疗、化疗等传统模式疗效欠佳，5年生存率仅有50%。宫颈癌的病因学研究表明高危型HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有宫颈癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达，HPV病毒蛋白作为一种抗原可刺激机体产生针对HPV的免疫反应，这就促使人们希望通过疫苗免疫治疗的方法来治疗和预防宫颈癌。HPV58型是1988年先后由中国和日本学者发现。我国最近完成的两项中国与亚洲妇女子宫颈中HPV型别分布的Meta研究结果显示HPV58是在我国子宫颈癌妇女中继HPV16 和18之后的另一重要的HPV优势型别，是我国北方和南方乃至亚洲地区子宫颈癌标本中均为第3位最常见的HPV型别。由于全球HPV16和18分布广泛而58型仅在亚洲各国比较常见，使西方国家对于HPV58型的研究极少。目前国外不论是已经上市或正在研究的HPV疫苗，都以16和18型为主，并没有包含58型。并且目前上市的仅有HPV预防性疫苗，对于已经罹患HPV感染甚至发展为宫颈癌前病变或宫颈癌的患者无效。由于HPV16、18与58基因的同源性仅有60 %，一些HPV16型常用的抗原表位如HPV16E711-20、49-57在HPV58型并不存在，因此，HPV16U8型疫苗对HPV58型感染并没有交叉保护作用。目前关于HPV16和18 型疫苗的研究已经很多，但对于HPV58型疫苗的研究仍然非常缺乏。面对我国宫颈癌患者中HPV58高感染率的现状，HPV58型治疗性疫苗研制是非常必要和迫切的。目前研究HPV疫苗主要有三个策略，第一种是预防HPV感染的预防性疫苗，主要通过产生中和抗体以抵抗病毒进入宿主上皮基底角化细胞内，目前最有希望的是包含有Ll 或L1/L2病毒壳蛋白的病毒样颗粒(VLPs)疫苗，这类疫苗主要用于年轻女性感染HPV之前，对已感染HPV或已有宫颈癌前病变或宫颈癌的女性无效。第二种是治疗性疫苗，主要通过刺激细胞介导的免疫反应以去除隐藏和表达病毒蛋白的细胞，这种疫苗应该能够阻止已经感染了病毒的角化细胞的增殖和促进已生长肿瘤的消退。因此，这类疫苗主要用于已经感染了 HPV或已经罹患宫颈癌前病变或宫颈的患者。由于HPV的早期基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。第三策略是兼具预防和治疗作用的联合疫苗，这种疫苗的靶抗原既包含有Ll或L1/L2病毒壳蛋白又包含HPV的早期基因E6和E7。因此，这种疫苗既能产生强的中和抗体，又能诱发特异性CTL反应，以产生预防和治疗的效果，防止病毒的感染和扩散，清除手术或治疗后残余的肿瘤细胞。采用HPV58型衣壳蛋白Ll或L1/L2为靶抗原研制的病毒样颗粒(VLPs)疫苗的报道有①田厚文等于2002年构建的表达人乳头瘤病毒58型Li、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株；②李文生等于2007年预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗； ③Siang T等于2010年构建的HPV16/18/58三价VLPS疫苗。然而，此类疫苗存在如下问题 由于Li、L2衣壳蛋白在宫颈癌及癌前病变组织中不表达，故上述疫苗只能用于预防HPV58 型感染，但对已发生感染或病变的宫颈组织治疗无效。采用HPV58早期蛋白El或E2为靶抗原研制的疫苗的报道有张晓丽等于2009年构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2，但仅进行了体液免疫检测证明有抗E2特异性抗体产生，而没有进行细胞免疫相关实验的检测。此类疫苗存在如下问题E1和E2蛋白虽然涉及病毒游离基因的复制和病毒早期基因的转录，可能是感染早期好的靶抗原，但由于El和 E2蛋白的表达水平非常低以至难以被免疫系统所识别，而让病毒逃逸。而且，这两个基因通常在肿瘤生长的早期即病毒基因整合入宿主染色体时被敲出，因此，并不是理想的靶抗原。采用HPV58早期蛋白E6或E7为靶抗原(目前HPV治疗型疫苗研制过程中最常用的两个靶抗原)研制的疫苗的报道有⑴单独使用E6或E7基因作为靶抗原，罗利群等于 2003年制备了含HPV58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果，发现经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低，免疫小鼠后能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期，说明该疫苗有一定的抗肿瘤效果。然而，此类疫苗存在如下问题由于仅利用了 HPV58E7基因作为抗原而忽略了另一个重要基因E6的抗原性，并且没有协同相关的佐剂来打破免疫耐受，因此该疫苗的作用尚待提高。( 未见使用E6和E7融合基因作为靶抗原。暂无采用HPV58L1和L2联合E6和E7为靶抗原研制的嵌合疫苗的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想的HPV58 型E6/E7融合基因及治疗性复合基因疫苗，用于治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变。为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案HPV58型E6/E7融合基因，该融合基因去除了 HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸都突变成甘氨酸。HPV58型E6/E7融合基因在制备治疗或预防宫颈癌的疫苗中的应用。上述疫苗为治疗性复合基因疫苗，该疫苗以融合基因为靶抗原，以hIL12作为抗原佐剂。靶抗原由融合基因片段插入pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒 pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI,再将 sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 片段从 pCI 载体上切下来而得。该疫苗采用的载体为PVAXl-IRES-hIL12，它对靶抗原sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI和 hIL12可共表达。该疫苗是PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12 (简称PVAXl-HPV58mE6E7Fc-hIL12)。治疗性复合基因疫苗的构建方法，该方法包括以下步骤<1>制备靶抗原先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成 HPV58E6E7融合基因，再将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和 92位氨基酸都突变成甘氨酸，构建成HPV58mE6E7融合基因；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段插入pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI WpCI载体上切下来；<2>选择载体采用带有hIL12、双亚基共表达的疫苗表达载体 PVAXl-本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＨＰＶ５８型Ｅ６／Ｅ７融合基因，其特征在于该融合基因去除了ＨＰＶ５８型Ｅ６和Ｅ７基因的终止码，同时将Ｅ６蛋白上的第５０、６３和１０６位氨基酸和Ｅ７蛋白上的第２４、２６和９２位氨基酸都突变成甘氨酸。
【技术特征摘要】
1.HPV58型E6/E7融合基因，其特征在于该融合基因去除了 HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸都突变成甘氨酸。2.根据权利要求1所述的HPV58型E6/E7融合基因在制备治疗或预防宫颈癌的疫苗中的应用。3.根据权利要求2所述的疫苗为治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗以所述融合基因为靶抗原，以hIL12作为抗原佐剂。4.根据权利要求3所述的治疗性复合基因疫苗，其特征在于所述靶抗原由所述融合基因片段插入pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来而得。5.根据权利要求4所述的治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗采用的载体为 PVAXl-IRES-hIL12，它对所述靶抗原 Sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 和 hIL12 可共表达。6.根据权利要求5所述的治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗是PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹤，于继云，李力，
申请(专利权)人：广西医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：45
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