本发明专利技术公开了一种抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白TAT-VP28及制备和用途。其序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸和SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，菌株为重组基因工程菌株EscherichiacoliBL21(pET-28a-TAT-VP28)。从对虾虾体中提取WSSV并通过PCR获得VP28基因，通过PCR的方法扩增TAT-VP28序列，然后构建重组质粒pET-28a（+）-TAT-VP28。将重组质粒pET-28a（+）-TAT-VP28转化大肠杆菌BL21（DE3）。基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。在预防对虾白斑综合症上有更高，更长的保护效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物工程
更具体涉及一种重组融合蛋白TAT-VP^亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶一种蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)和对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP^融合蛋白的基因工程菌株；还涉及上述菌株表达的融合蛋白在抗对虾白斑综合症病毒的药物中的用途。
技术介绍
上世纪80年代以来，世界对虾养殖业高速发展，随着环境的日益破坏，病害问题加剧，已经成为阻碍对虾养殖业发展的重要因素。对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 自1992年首次在台湾爆发以来，先后分别在日本、东南亚、北美等国家爆发，在全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。1995年，联合国粮油组织(FAO)，国际兽药局(OIE) 以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。近年来各国专家学者们对白斑综合症病毒进行了深入研究，探讨了其形态结构、基因组成、分类学、感染宿主以及与病毒感染相关的蛋白。为防治WSSV感染提供了重要的理论依据。WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状，具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外，桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。WSSV的主要结构蛋白有VP15、VP19、VP24, VP26, VP^，编码这些蛋白的阅读框通过对其N-端氨基酸序列的测定已确定。VP19、VP^是主要的囊膜蛋白。对VP^ 蛋白的结构分析可以发现，VP28蛋白的结构中存在5个潜在的N-糖基化位点，2个潜在的 0-糖基化位点及9个可能的磷酸化位点。同时，在蛋白的N-端存在强疏水区，且这个区域中包含一个理论上的跨膜结构域。van Hulten第一次利用VP^蛋白的抗体中和实验证明了该蛋白与 WSSV 感染的早期过程有关(van Hulten，Μ. C. W.，ffitteveldt, J.，Snippe， Μ. , Vlak, J. Μ. . White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp · Virology,2001b,285 :228-233.)。在van Hulten 的研究基础上，Yi进一步研究了 VP^蛋白在WSSV感染过程中的具体作用，进一步证明了 VP28蛋白参与WSSV对虾细胞的吸附及侵入过程(Yi, G.，Wang，Ζ.，Qi，Y.，Yao, L.，Qian, J., Hu, L. . VP28 of white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells . J. Biochem. Mol. Biol，2004，37 :726-734.)。近年来研究发现能够与VP^蛋白相互作用的宿主细胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70 (heat shock cognate protein 70) > STAT (signal transducer and activator of transcription)。近年来各国学者一直致力于对WSSV流行病学及致病机理的研究，以寻找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增强剂来增强对虾抗病毒的感染能力、利用抗体中和作用来阻断WSSV的感染、利用疫苗提高对虾抗WSSV病毒的能力。目前研究证明能够增强对虾抗WSSV感染能力的免疫增强剂主要有脂多糖 (Lip0p0lySacCharides，LPQ，葡聚糖(Glucan)。Zhu研究的灭活疫苗能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV的感染，灭活疫苗是以二乙烯亚胺(Binary ethylenimine, BEI)作为灭活剂的，BEI作为灭活剂时WSSV的囊膜蛋白可以保持完整(Fei Zhu, Huahua Du, Zhi-Guo Miao, Hai-Zhi Quan, Zi-Rong Xu. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivated WSSV. Fish & Shellfish Immunology. 2009,26 :685-690)。Witteveldt利用原核表达载体在大肠杆菌中重组表达 VP28融合蛋白，将纯化的VP^融合蛋白通过肌肉注射到对虾体内，在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP^融合蛋白注射组存在较高的相对存活率(Jeroen ffitteveldt, Just M. Vlak, Marielle C. W. , van Hulten. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine , Fish & Shellfish Immunology. 2004，16 :571-579)。Du 利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP^蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白与对照组相比，对鳌虾有较好的保护作用(Huahua Du, Zirong Xu, Xiaofeng ffu, Weifen Li, Wei Dai. Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus. Aquaculture. 2006,260 39-43)。Xu利用杆状病毒(HyNPV)表达系统在家蚕体内分别表达重组的VP^及VP19蛋白，并将带有重组蛋白的家蚕勻浆液包裹虾饲料，连续投喂克氏原鳌虾30天。投喂结束后即进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，VP^蛋白组及VP19蛋白组的相对存活率分别为94. 7%和89. 5%。这说明与肌肉注射相比，口服的亚单位疫苗同样可以对克氏原鳌虾产生保护作用(Zirong Xu a, Huahua Du, Yaxiang Xu, Jianyi Sun, Jian Shen. Crayfish Procambarus clarkii protected against white spot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed in sil本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟小林，徐进平，王健，张毅，宁建芳，
申请(专利权)人：武汉凯肽来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：83
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