本发明专利技术公开了一种罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH及制备方法和应用。从雄性罗非鱼的脑垂体中提取总mRNA，通过RT-PCR得到cDNA，再通过PCR扩增获得罗非鱼生长激素GH的基因，PCR重叠延伸的方法扩增TAT-GH基因；构建重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH。将重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH转化大肠杆菌BL21（DE3），在IPTG诱导下，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式得到高效表达，再通过纯化复性得到活性蛋白，喂食罗非鱼幼苗后能有效地促进其生长发育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物工程
，具体涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH，还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH的制备方法，还涉及一种能表达重组口服生长素蛋白TAT-GH的基因工程菌株；还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH在促进罗非鱼生长中的应用。
技术介绍
鱼类生长激素(growth hormone,GH)是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。鱼类GH的分离工作始于上世纪70年代，在80年代中后期形成热点。其最初的分·离技术类似于哺乳类GH的分离，通常将鱼的脑垂体或体外培养的分泌液在碱性条件下匀浆，经柱层析分离后，再采用等电点沉淀法得到较高浓度的GH，但此法沉淀得到的GH溶解度低，难以溶解。不少学者改进方法，采用柱层析后经离子交换层析，再用rpHP LC纯化，或是通过葡聚糖凝胶过滤和反相高效液相色谱纯化两步法得到GH。目前，国内外已有二十多种鱼GH被分离纯化出来，并对这些鱼类GH的氨基酸全序列进行了分析和鉴定，也证明了不同物种间的同源性与差异性。鱼生长激素展现了典型的GH特征，如四个半胱氨酸残基，能形成两个二硫键的能力，推测其能使GH分子形成三级结构和N糖基化位点。对于骨鳔类鱼，GH的序列包含有一组不成对的半胱氨酸残基，推测起着未知的重要功能。本专利技术所研究的罗非鱼(tilapia)原产于非洲，俗称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目丽鱼赴罗非鱼属，为一种中小型鱼。罗非鱼的肉味鲜美，肉质细嫩，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，现在已作为世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类。其cDNA的开放阅读框为615bp，编码204个氨基酸，具有鱼类生长激素的基本结构特征从起始氨基酸M到第17位氨基酸S是信号肽部分，成熟肽是187个氨基酸。成熟肽中有4个半胱氨酸，位置非常保守，它们在成熟肽中形成两个二硫键(C69与C177位、C194与C202位)，构成特征性的一个大环和一个小环。在第201位上有一个N-糖基化位点，这个糖基化位点是蛋白转导入膜的信号，也是硬骨鱼GH的特征之利用基因工程菌表达鱼类生长激素是目前大量生产鱼生长激素的主要途径。目前已有多种鱼类GH在大肠杆菌中表达，但由于表达产物通常需要复性处理，耗时耗材，所以不是最理想的表达系统。酵母表达系统可以避免这些缺陷，是一种比较方便和有效的表达系统。而藻类和昆虫等作为表达载体的宿主，可能会获得更高表达量或是更经济的生产鱼GH的途径。细胞生物学研究领域中有一类具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度一般小于20个氨基酸，被命名为细胞穿膜肽或蛋白转导域(PTD)。如人类免疫缺陷病毒(HIV)后期转录的调控子蛋白TAT即为PTD的一种。按照结构和功能的不同可以将TAT蛋白划分为5个区域①酸性N-末端区(1-20位);②半胱氨酸Cys富积区(21 - 39位)，含7个Cys，在HIV的各亚型属于中高度保守核心区(40-47位)，含RKGLGI氨基酸序列基本区(48-72位)，含RKKRRQRRR氨基酸序列，且具有TAR RNA结合活性；⑤细胞黏附的C-末端区(73-86位)，含RGD氨基酸序列，TAT可通过RGD与细胞整合素结合。通过对TAT的序列进一步的研究已确定其第48-57位(RKKRRQRRR)碱性肽段是保持其穿膜活性的最小片段。穿膜肽TAT可以携带多种物质，大至亲水性蛋白和多肽，小到DNA甚至颗粒性物质等，都能高效而快速地进行细胞间或细胞内的传输，且对细胞无毒副作用。TAT蛋白介导的细胞内转运过程存在多种机制。最初推测是非受体、非转运蛋白介导的和非内吞机制，但最终证实其入胞过程是能量依赖的，且需要细胞表面的蛋白多糖的作用。有研究证明，TAT介导的多种物质的入胞机制与其所携带的分子大小密切相关。当TAT连接的是大分子或颗粒性物质时，遵循的是一种能量依赖的内吞途径，然后从核内体中释放出来进入胞浆；而单独的TAT多肽(49-57位)或仅连有小分子的TAT (49-57位)入胞过程则是通过与细胞表面发生静电作用或氢键连接而完成的，该过程是非能量依赖的。总之，TAT穿膜的具体机制还有待研究。 尽管TAT的穿膜机制还不太明了，但以其为代表的系列穿膜肽已经广泛应用于生物和医药学领域，大大推进了分子生物学、细胞生物学、药学、免疫学等的发展。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供了一种TAT-GH融合蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示。本专利技术首次将穿膜肽TAT与鱼生长激素(growth hormone, GH)融合表达,获得的融合蛋白可以顺利穿过肠膜细胞，进入血清中直接发挥其促生长作用。本专利技术的另一个目的在于提供了一种TAT-GH融合蛋白的制备方法，通过PCR重叠延伸技术，以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因。通过双酶切重组质粒pGEM_T-TAT_GH和质粒pET-32a，连接得到重组质粒pET-32a-TAT-GH，转化E. coli DH5a,得到Escherichiacoli DH5a pET-32a_TAT_GH。将质粒 pET-32a_TAT_GH 转化到表达菌株 Escherichia coliBL21 (DE3)，所得阳性克隆即为本专利技术涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株，将该菌株转接到2XYT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。本专利技术的另一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3),CCTCC NO :M2012148。该菌株可以表达穿膜肽TAT和罗非鱼生长激素(growth hormone)的基因工程融合蛋白TAT-GH，使其能顺利穿过细胞膜进入胞内产生作用，该菌株能大量表达TAT-GH蛋白，且操作简便快捷，可更好的应用于工业化生产中，为制备口服促生长制品提供良好的基础。本专利技术还有一个目的是提供了一种TAT-GH表达蛋白在促进罗非鱼生长中的应用，通过选取大小不同的幼鱼，用一定剂量的融合蛋白分别以不同时间间隔对其口服喂食，观察其促生长效果的差异性，可得出最优化的饲养方式。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施从雄性罗非鱼脑垂体内提取总RNA，以Oligo (dT) 20为引物合成cDNA第一条链。根据Genbank上已经登录的GH序列设计引物，运用RT-PCR方法扩增罗非鱼GH cDNA序列，与运用搭桥法扩增得到的TAT-GH基因分别克隆到表达载体pET32a (+)上，转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中，经菌落PCR和双酶切鉴定得到阳性重组菌，IPTG诱导表达。将纯化的GH和TAT-GH蛋白通过酶联免疫吸附受体测定法(ELISA-RA法)测定其生物学活性，并口服喂食罗非鱼，一段时间后抽取鱼的血清用间接ELISA法检测鱼体内GH含量，证明TAT多肽穿膜活性。蛋白口服喂食罗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种分离重组的基因，其特征在于，其序列为SEQ ID N0:1所示。2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于，其序列为SEQ ID N0:2所示。3.—种表达权利要求2所述融合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于大肠杆菌(Escherichia coli ) BL21 (DE3) pET-32a-TAT-tmGH, WompT hsdSB (rBmB) galdcm (DE3) ； CCTCC NO :M2012148。4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为 A.罗非鱼生长激素基因的制备取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取GH的总mRNA后，以Oligo (dT)20为引物通过RT-PCR得到cDNA，同时设计GH的PCR上下游引物，扩增得到GH基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；GH 的上游引物 Pl :5’ -CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’ ；GH 的下游引物 P2 :5’ -CGGAAITCCTACAGAGTGCAGITTGC...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟小林，徐进平，王健，曾辉，
申请(专利权)人：武汉凯肽来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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