本发明专利技术公开一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白制备方法及其应用，通过基因工程手段，经过PCR扩增，连接T载体，双酶切得到蛋白A和蛋白G免疫球蛋白结合区基因，然后一起连接到表达载体pET-23a上构成重组质粒，并转化E.coli?BL21(DE3)，诱导表达后得到大量含有融合蛋白AG的菌体。通过超声破碎、高温加热、沉淀DNA、弱阴离子交换层析和亲和层析纯化得到融合蛋白AG。该蛋白具有蛋白A和蛋白G的双重优点，结合谱更为广泛，且对血清中白蛋白等非免疫球蛋白物质非特异性吸附低。将该蛋白作为配基连接到固相载体基质上制成吸附剂，解决了蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，可用于抗体纯化以及血液净化等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种对抗体具有广谱吸附能力的融合蛋白AG的制备方法及其在抗体纯化和血液净化等领域中的应用。
技术介绍
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases, AID)是在特定情况下,机体自身耐受机制遭到破坏，免疫系统将自身的物质错误地识别为外来有害物质，致使自身抗体和自身反应性T淋巴细胞识别并损害机体自身正常细胞、组织、器官，从而导致一系列病变。由于自身抗体和免疫复合物在自身免疫性疾病中的致病性已被证实，通过吸附剂体外清除的方式降低病人血液中自身抗体和免疫复合物的浓度能够明显改善症状，对疾病可以起到缓解和治疗作用，在临床中已得到广泛应用。蛋白A免疫吸附柱是目前在自身免疫性疾病治疗中用量最大、治疗效果最好的吸附柱。Immunosorba 和Prosorba 是两种最常用的蛋白A类免疫吸附柱,_■者均获得了美国食品药品管理局(FDA)认证，广泛用于治疗免疫球蛋白相关疾病。蛋白A免疫吸附柱的关键成分是功能基蛋白A。蛋白A (Staphylococcus aureusproteinA, SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组分，占整个细胞壁蛋白的6. 7%，以共价键的形式与胞壁肽聚糖相结合，分子量为42kDa，等电点pH 5. 1，易被同位素碘所标记，对热和变性因子稳定，其分子含4个酪氨酸残基，无色氨酸。不含有半胱氨酸，所以分子中不含有二硫键。蛋白A分为三个部分信号肽序列(S)，五个高度同源的IgG结合结构域(E、D、A、B、C)以及锚定蛋白结构域(X)。蛋白A能与人及多种哺乳动物血清IgG中的Fe片段结合，但亲和性各不相同，具有种系选择性。此外，其还能与血清中少量的IgM和IgA结合。同时，蛋白A与人不同类型免疫球蛋白的结合能力也不同，其对IgG的结合率为gswagGiiooG/o，IgG2100%, IgG4100%, IgG335%), IgM 51%, IgA 14%, IgE 7%。ProteinA 的结构域示意图(如图6)然而蛋白A免疫吸附剂在30年的临床应用中也存在一些弊端，譬如其与人IgG3结合力较弱，对于一些致病抗体包含IgG3的疾病如系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病效果不显著。为了克服蛋白A吸附剂的上述缺陷，本专利技术将一段与人IgG3具有较强结合能力的蛋白G的基因与蛋白A的抗体结合结构域基因相连接，实现AG融合蛋白的重组表达，进而制备的融合蛋白AG吸附剂将弥补蛋白A吸附剂对IgG3结合力弱的不足，提高其对系统性红斑狼疮、扩张性心肌炎等疾病的治疗效果。链球菌蛋白G (Streptococcus protein G, SPG)是一种存在于A、C、G群链球菌的细胞壁的蛋白，完整的蛋白分子量为64 65kDa，对热比较稳定，分子结构中没有二硫键，呈长纤维状。蛋白G分子中包含两至三个序列高度同源的免疫球蛋白结合域(C1、C2、C3)，位于分子的C末端，其单结构域由两对反向平行的β片层和中间的一个α螺旋组成。其分子中还包含有信号肽(S)、白蛋白结合结构域(A、B)以及细胞壁锚定蛋白结构域(W、Μ)。蛋白G具有与人和哺乳动物IgG结合的能力，与人IgG的4个亚类均具有较强结合能力，包括IgG3，但不与IgA、IgM、IgD和IgE结合。研究表明，完整的蛋白G分子可与人IgG的Fe片段以及Fab片段同时结合，还可与人血清白蛋白结合。蛋白G已广泛用作免疫学试剂，主要应用于免疫学探针以及IgG的纯化。Protein G的结构域示意图(如图7)可以看出，蛋白A与蛋白G在功能上具有互补性，两者的融合蛋白具有更好的结合特性，既可以弥补蛋白A对于IgG3结合力弱的不足，又可以弥补蛋白G不结合其它类型免疫球蛋白的不足，是更为理想的免疫球蛋白结合蛋白。融合蛋白AG结构示意图(如图8) 1988 年，Eliasson 等人(Eliasson et al. Chimeric IgG-binding ReceptorsEngineered from Staphylococcal Protein A and Strptococcal ProteinG. 1988，263(9) : 4323-4327)首次利用大肠杆菌将蛋白A与蛋白G进行融合表达，得到了包含蛋白A信号肽、5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的3个免疫球蛋白结合区的融合蛋白。该蛋白相对于蛋白A和蛋白G具有更为广泛的免疫球蛋白结合谱，同时也具有更强的结合能力。具体结构如图9 (A)所示，表达的融合蛋白(63kDa)在蛋白A和蛋白G之间含有一大段与免疫球蛋白结合无关的区域(llkDa)。另一种融合蛋白是将2个Z区域(将蛋白A的B区域进行改造得到，第30位氨基酸突变，F — A)与蛋白G的C1、C2和C3区域连接而得，结构如图9 (B)所示，得到的融合蛋白ZZG虽然结合谱有所扩大，但是由于抗体结合区较少，对IgG的结合能力不如前一种融合蛋白。两种融合蛋白结构示意图(如图9)。1992年，Sun和 Lew(Sun and Lew. Chimaeric protein A/protein G and proteinG/alkaline phosphatase as reportermolecules. 1992，152:43-48)利用 pGEX 载体，构建了含有谷胱甘肽-S转移酶(GST)标签、蛋白A的5个免疫球蛋白结合区以及蛋白G的2个免疫球蛋白结合区的重组融合蛋白表达质粒，利用大肠杆菌进行表达。该融合蛋白结合谱较蛋白A或蛋白G广，但是由于加入了 GST标签，导致该融合蛋白对血清中其他蛋白有非特异性吸附。一种融合蛋白结构示意图(如图10)1995年，APPLIED IMMUNE SCIENCES. INC利用化学合成方法合成了包含蛋白A的B区域及蛋白G的C3区域的蛋白SBG (21. 7kDa)，且含有部分锚定蛋白区域，具体结构如图11所示。这种融合蛋白获得了蛋白A和蛋白G的优点，但是抗体结合位点较少，片段较小，吸附效果不如蛋白 A 或蛋白 G(Chimeric Receptor Containing One IgG binding DomainOf ProteinAand Protein G. PCT/US94/09141)。一种融合蛋白结构不意图(如图 11)2004年，上海润龙生物科技有限公司以葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C，大消化链球菌蛋白1^的則、82、83、84、85(高度同源的186结合结构域，主要与免疫球蛋白的κ轻链可变区结合)，C和G群链球菌蛋白G的C1、C2为结构单元，随机连接，构建重组免疫球蛋白结合分子文库。将该文库展示在噬菌体表面，并以免疫球蛋白对该文库进行3 4轮亲和筛选，获得一系列高亲和力免疫球蛋白结合分子，但是这种打乱结构单元进行重组的方法，破坏了蛋白A、蛋白G和蛋白L原有的免疫球蛋白结合位点的连续性，且抗体结合域不多于6个，吸附效果并不十分理想。而且噬菌体展示技术也存在肽库容量较小、肽库的多样性受限、氨基酸修饰受宿主菌限制等缺点(一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法，申请号 200410067157. 2)。目前，商品化的用于抗体纯化的吸附材料主要有GE公司的蛋白A吸附材料和蛋白G吸附材本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白AG基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO 5所示。2.如权利要求I所述的融合蛋白AG基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNO 6所示。3.一种重组表达融合蛋白AG基因的质粒，其特征在于以pET-23a为表达载体，插入权利要求I所述的融合蛋白AG基因得到的重组表达质粒。4.一种重组表达融合蛋白AG的重组菌株，其特征在于由权利要求3所述的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)得到的重组菌株。5.利用权利要求4所述的重组菌株表达融合蛋白AG的方法，其特征在于包括如下步骤利用表达载体pET-23a构建含有权利要求I所述融合蛋白AG基因的重组表达质粒；用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾凌云，张嘉玉，任军，徐丽，谢健，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：
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