本发明专利技术涉及通过一步酶促反应从相应前体形式制备胰岛素化合物(包括它们的类似物或其衍生物)的方法，该方法包括以最佳的量组合并且同时使用协同作用的胰蛋白酶和羧肽酶B，从而以可控方式指导反应以避免随机不希望副产物的产生。具体地，本发明专利技术所述的酶转化反应提供了以下优势：减少操作步骤的数目，所需最终产物的得率和纯度更高。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过一步酶促反应从相应前体形式制备胰岛素化合物(包括它们的类似物或其衍生物)的方法，该方法包括组合并且同时使用适量的协同作用的胰蛋白酶和羧肽酶B，从而以可控方式指导反应以避免随机不希望副产物的产生。具体地，本专利技术所述的酶转化反应提供了以下优势减少操作步骤的数目，所需最终产物的得率和纯度更高。
技术介绍
基因工程方法逐渐使得能够在微生物中表达胰岛素的前体形式(EP-A-347 781、 EP-A-367 163)。通常，通过化学和/或酶切割去掉前序列原(pre pro sequences) (DE-P-3 440 988、EP-A-O 264 250)。已知的酶转化方法是基于胰蛋白酶和羧肽酶B切割的(Kemmler W.等人，J. Biol. Chem.，246 (1971) 6786-6791 ；EP-A-195691 ；EP-B-89007)。 在胰岛素前体分子转化为相应分子的典型过程中，除去了 A和B链之间的接头肽(linker peptide)。胰蛋白酶的酶促反应是酶促的复杂反应，其不但切割在切割后会产生人胰岛素或所需最终产物的那些肽键，而且在竞争反应中还切割在切割后会产生多种不希望的副产物的其它敏感位点处的肽键。现有技术的方法包括以在反应中将形成所需中间产物时加入第二酶羧肽酶的方式，使用胰蛋白酶和第二酶羧肽酶。这些方法的缺点在于形成了从反应溶液中难以除去的大量杂质副产物。在将人胰岛素前体形式转化为人胰岛素(人胰岛素，HI)的具体情况下， 形成了大量 des-Thr (B30)-人胰岛素(des-Thr (B30) -HI)。根据上述内容，很明显以下情况将是有利的采用更简单的酶促反应方法，通过能够尽可能完全除去可能形成的聚合物杂质并同时能够尽可能提高所需胰岛素最终产物浓度的更简单的步骤将前体胰岛素化合物、它们的类似物及其衍生物切割成胰岛素。需要额外的条件以确保高整体得率，从而提高操作的容易程度、所需最终产物的质量和数量。已通过在本专利技术中所实施的酶促反应改善了已知方法的缺点，并且已证明在不希望副产物不增加的情况下，得率的提高与有益反应条件下所使用的胰蛋白酶和羧肽酶的最佳浓度有关。本专利技术人已试图开发了改善的一步酶促反应方法，其包括以最佳的量组合并且同时使用协同作用的胰蛋白酶和羧肽酶B以提供所需的最终产物，从而提高了操作的容易程度、最终产物的纯度和产率。专利技术目标本专利技术的主要目标是获得在形成最少的不希望副产物的情况下从相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，该方法是通过一步酶促反应实现的，其包括组合并且同时使用协调作用的适量(最佳量)的胰蛋白酶和羧肽酶B以提供所需的最终产物。本专利技术的另一个主要目标是提供SEQ ID 1、2、3、4、5、6、7和8所示的可以用作起始材料的胰岛素类似物前体，所述前体可以是液体或结晶形式。本专利技术的另一个目标是提供用于表达胰岛素原或其类似物或衍生物的表达载体，所述表达载体包含编码前体分子的所述各DNA序列。本专利技术的另一个目标是提供用所述表达载体转化并随后提供制备各胰岛素化合物的方法的适合微生物/宿主，其包括在适合的发酵培养基和发酵条件下培养所述转化的微生物以产生前体胰岛素形式。本专利技术的另一个目标包括通过一步酶促反应将胰岛素化合物前体形式转化为它们各自的活性形式的方法，其中以允许协同并且受控反应一同加入适量的胰蛋白酶和羧肽酶，从而最少地产生不希望的终产物。本专利技术的另一个目标是获得从各自前体对应物得到胰岛素或其类似物或其衍生物的方法，其包括按顺序而连续进行这些步骤。本专利技术的另一个目标是获得胰岛素分子。本专利技术的另一个目标是获得胰岛素分子，其选自包括胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛(glulisine)或IN-105的组。
技术实现思路
因此，本专利技术涉及从相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，其包括在胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1至约50 1的前提下，以组合并且同时使用的胰蛋白酶和羧肽酶处理所述前体；从各自前体对应物获得胰岛素或其类似物或其衍生物的方法，其包括以下列连续顺序连续进行下列步骤(a)在缓冲溶液中溶解适量的胰岛素或胰岛素衍生物的前体；(b)制备pH范围在约7. 0至9. 0的前体溶液的多个等份；(c) 将胰蛋白酶和羧肽酶同时引入到步骤(b)中所制备的多个等份中并且将所述混合物孵育约4-10小时；(d)通过加入柠檬酸缓冲液和SiCl2使所需胰岛素产物沉淀；制备了胰岛素分子并且胰岛素分子来自包括胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素(glulisine)或 IN-105 的组。所附序列表的简要说明SEQID1门冬胰岛素(Aspart)前体分子的氨基酉I序列。SEQID2门冬胰岛素前体分子的氨基酸序列。SEQID3门冬胰岛素前体分子的氨基酸序列。SEQID4赖脯胰岛素(Lispro)前体分子的氨基酉I序列。SEQID5赖脯胰岛素前体分子的氨基酸序列。SEQID6赖脯胰岛素前体分子的氨基酸序列。SEQID7赖谷胰岛素(glulisine)前体分子的氨基酸序列。SEQID8赖谷胰岛素前体分子的氨基酸序列。SEQID9赖谷胰岛素前体分子的氨基酸序列。具体实施例方式本专利技术涉及从由以下化学式所表示的相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，所述化学式为其中，R为氢，或者可化学或酶切割的氨基酸残基，或者包含至少两个氨基酸残基的可化学或酶切割的肽；R1为OH或者氨基酸残基，或者Y1-Y2，其中Y为氨基酸残基；A1至A21部分对应于胰岛素A链，而B1至B27部分对应于胰岛素B链，所述胰岛素 B链包含氨基酸取代、缺失和/或氨基酸的添加；R2 为 Z「&，其中 Z1 选自 Pro、Lys、Asp，Z2 选自 Lys 或 Pro 或 Glu,或者为 Z1-Z2-Z3, 其中4选自ftx)、Lys, Asp, 4选自Lys或Pro或Glu，而&为苏氨酸或至少三个氨基酸残基的肽部分，前提条件是对应于B30的氨基酸为苏氨酸；X为将A链连接到B链的多肽，其可以在不打断A链或B链的情况下被酶切割，X 具有至少两个氨基酸，其中第一个和最后一个氨基酸为赖氨酸或精氨酸；所述方法包括以组合并且同时使用的胰蛋白酶和羧肽酶处理所述前体，前提条件是胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1至约50 1。在本专利技术的另一个实施方式中，各个前体分子包含与SEQ ID 1、2、3、4、5、6、7、8和 9所示的氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列。在本专利技术的另一个实施方式中，胰蛋白酶与胰岛素前体的相对量在约1 10至约 1 500的范围内。在本专利技术的另一个实施方式中，其中胰蛋白酶与胰岛素前体的相对量为约 1 100。在本专利技术的另一个实施方式中，羧肽酶与胰岛素前体的相对量为约1 500。在本专利技术的另一个实施方式中，胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1至约 50 1。在本专利技术的另一个实施方式中，胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1。在本专利技术的另一个实施方式中，用于转化反应的胰蛋白酶浓度为至少0.01mg/ml。在本专利技术的另一个实施方式中，用于转化反应的羧肽酶浓度为至少0. 001mg/mL·在本专利技术的另一个实施方式中，所述前体为液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种从以下化学式所表示的相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，所述化学式为：其中，Ｒ为氢，或者可化学或酶切割的氨基酸残基，或者包含至少两个氨基酸残基的可化学或酶切割的肽；Ｒ１为ＯＨ或者氨基酸残基，或者Ｙ１－Ｙ２，其中Ｙ为氨基酸残基；Ａ１至Ａ２１部分对应于胰岛素Ａ链，而Ｂ１至Ｂ２７部分对应于胰岛素Ｂ链，所述胰岛素Ｂ链包含氨基酸取代、缺失和／或氨基酸的添加；Ｒ２为Ｚ１－Ｚ２，其中Ｚ１选自Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ，Ｚ２选自Ｌｙｓ或Ｐｒｏ或Ｇｌｕ，或者为Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３，其中Ｚ１选自Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ，Ｚ２选自Ｌｙｓ或Ｐｒｏ或Ｇｌｕ，而Ｚ３为苏氨酸或至少三个氨基酸残基的肽部分，前提条件是对应于Ｂ３０的氨基酸为苏氨酸；Ｘ为将Ａ链连接到Ｂ链的多肽，其可以在不打断Ａ链或Ｂ链的情况下被酶切割，Ｘ具有至少两个氨基酸，其中第一个和最后一个氨基酸为赖氨酸或精氨酸；所述方法包括以组合并且同时使用的胰蛋白酶和羧肽酶处理所述前体，前提条件是胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约５∶１至约５０∶１。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2008.08.07 IN 01904/CHE/20081. 一种从以下化学式所表示的相应前体制备胰岛素化合物及其类似物或衍生物的方法，所述化学式为2.根据权利要求1所述的方法，其中各个所述前体分子包含与SEQID 1、2、3、4、5、6、 7、8和9中所示氨基酸序列至少85%相同的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中胰蛋白酶与所述胰岛素前体的相对量的范围为约 1 10 至约 1 500。4.根据权利要求3所述的方法，其中胰蛋白酶与所述胰岛素前体的相对量为约 1 100。5.根据权利要求1所述的方法，其中羧肽酶与所述胰岛素前体的相对量为约1 500。6.根据权利要求1所述的方法，其中胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1至约 50 1。7.根据权利要求6所述的方法，其中胰蛋白酶与羧肽酶的相对浓度比为约5 1。8.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述转化反应的胰蛋白酶浓度为至少 0. 01mg/mlo9.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述转化反应的羧肽酶浓度为至少0.OOlmg/10.根据权利要求1所述的方法，其中所述前体为液体或者结晶形式。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化反应是在PH6. 5至10下进行的。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化反应是在PH7至9下进行的。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化反应是在约2°C至40°C的温...
【专利技术属性】
技术研发人员：帕萨·哈兹拉，斯里坎斯·戈拉拉霍萨哈利·萨斯亚纳拉亚纳，苏玛·斯里尼瓦斯，曼朱纳斯·哈达瓦纳哈利·什瓦鲁德赖阿，克达纳斯·南祖德·萨斯特里，哈里什·耶尔，
申请(专利权)人：拜康有限公司，
类型：发明
国别省市：IN
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