多核苷酸引物制造技术

含有以下引物序列之一或其互补序列的至少最后6个核苷酸的多核苷酸：SEQ.ID?NO：3-16，18，20-33，35或37-39。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多核苷酸、含有多核苷酸的试剂盒，以及在基因中检测突变存在与否 的方法。
技术介绍
磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)是参与细胞信号传递的一大类脂质激酶。PII-AKT途 径在许多类肿瘤中被激活，导致细胞生长、增殖和存活异常(补充的1篇近期综述)。近来， 在人癌症中鉴定出了 IA型PI3K (PIICA)催化亚基中的突变[1]。这些突变在致癌作用中 的确切作用仍然并没有被明确确定，但随着许多靶向PI3K抑制剂的开发，突变检测对于患 者筛选来说变得日益重要。这些突变的检测中的技术难题来自于可能只包含少量突变序列 的肿瘤活组织切片的限制。另外，从石蜡包埋组织提取的DNA常常已被降解且质量很差。测 序检测所需要的突变DNA的最低水平是15-25%，因此对于开发能在异源样品中检测少量 突变的等位基因的灵敏的检测法以及进行所述检测法所需的产品具有迫切的需求。本专利技术试图满足该需求。
技术实现思路
本专利技术提供了对肿瘤引起的PIK3CA突变的灵敏耐用的检测法。根据本专利技术的一个方面，提供了一种多核苷酸，其含有下列引物序列之一的至少 最后6个核苷酸=SEQ. ID NO. 3-16，18，20-33，35或37-39，或其互补序列。也就是说，所述 多核苷酸含有下列引物序列之一 3，末端的至少6个核苷酸SEQ. IDN0. 3-16,18，20-33，35 或37-39，或其互补序列。优选地，所述多核苷酸包含下列引物序列之一、或其互补序列、或与其具有80%、 90%、95%或99%序列一致性的序列3，末端8、10、12、14、17、18或20个核苷酸或整个序列 的至少 75%的核苷酸SEQ ID NO. 3-16、18、20-33、35 或 37-39。在本专利技术的一些实施方式中，提供了一种多核苷酸，其包含以下引物序列之一 3’ 末端10个核苷酸的至少75%的核苷酸=SEQ. ID NO. 3_16、18、20_33、35或37-39，或其互补 序列。通常，所述多核苷酸短于100个核苷酸，优选短于80个核苷酸，更优选短于60个 核苷酸，更优选短于40个核苷酸，更优选短于30个核苷酸。优选地，所述多核苷酸还含有淬灭基团和荧光团。通常，所述淬灭基团和荧光团由含有第一和第二区域的核苷酸尾序列隔开，其中 所述第一区域的核苷酸与第二区域的核苷酸互补但呈反向，从而所述第一区域与第二区域 的杂交导致所述淬灭基团与所述荧光团足够靠近，以淬灭所述荧光团。优选地，所述尾序列还含有第三区域，其具有与PIK3CA基因的一个区域互补的序 列。优选地，所述多核苷酸含有SEQ ID NO :18的3’末端的至少6个核苷酸，并且所述尾序列含有SEQ. ID NO. 17。或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO :35的3’末端至少最后的核苷酸，并且所述尾 序列含有 SEQ. ID NO. ；34。或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO :39的3’末端至少最后的核苷酸，并且所述尾 序列含有SEQ. ID NO. 38。通常，所述淬灭基团含有Dabcyl。优选地，所述荧光团含有Hex，Fam或Rox。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种含有本专利技术的至少两种多核苷酸的试剂品.ο优选地，所述试剂盒含有包含SEQ ID NO. 18的多核苷酸和包含SEQ ID N0. 3-16 之一的多核苷酸；或含有包含SEQ ID N0. 35的多核苷酸和包含SEQ ID N0. 20-33之一的多 核苷酸；或含有包含SEQID N0. 39的多核苷酸和包含SEQ ID N0. 37的多核苷酸。通常，所述试剂盒还含有核苷三磷酸，聚合酶和/或缓冲液。根据本专利技术的另一个方面，提供了将本专利技术所述的多核苷酸或试剂盒，或含有 SEQ. ID N0. 3-16，18，20-33或35或其互补序列3，末端6个核苷酸中的4或5个的多核苷 酸用于检测含有PIK3CA基因的至少一个片段的核酸样品中的突变的用途。优选地，所述核酸样品中的PIK3CA基因所述片段长至少10个核苷酸，优选长20 个核苷酸，更优选长30个核苷酸，和更优选长40个核苷酸。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种检测PIK3CA基因中突变存在与否的方法， 该方法包括以下步骤a)混合含有PIK3CA基因的至少一个片段的核酸样品和一条多核苷酸，其含有下 列引物序列之一或其互补序列3，末端至少6个核苷酸=SEQ ID N0. 3-16或20-33 ；和b)检测所述多核苷酸与所述核酸样品的杂交，其中杂交表示突变的存在。通常，所述多核苷酸含有下列引物序列之一 SEQ ID NO :3-16或20-33。优选地，该方法还在步骤a)前包括以下步骤用热循环核酸扩增，优选PCR扩增 PIK3CA基因所述片段的拷贝数。优选地，步骤b)包括用所述多核苷酸作为第一引物进行DNA聚合，并检测聚合的 延伸产物。通常，步骤b)包括以下步骤将所述核酸样品和多核苷酸与对应于所述多核苷 酸互补区域下游的PIK3CA序列所述片段的一个区域的第二引物混合，并对该混合物进行 PCR。优选地，所述第二引物包含SEQ. ID NO. 18，并且所述多核苷酸包含SEQ. IDN0S. 3-16的3，末端6个核苷酸中的至少4或5个核苷酸；或所述第二引物包含SEQ. ID N0. 35，并且所述多核苷酸含有SEQ. ID N0S. 20-33的3，末端6个核苷酸中的至少4或5个核苷酸。另外，该方法还包含以下步骤用对照引物对所述样品进行PCR，并比较PIK3CA基 因的扩增和用所述多核苷酸和第二引物的扩增。优选地，所述对照引物含有SEQ ID N0. 37和39。通常，所述多核苷酸含有淬灭基团和荧光团，并且其中步骤b)包括使所述混合物暴露于在不存在淬灭基团时荧光团对其响应的波长的光下，并检测在不存在淬灭基团的情 况下荧光团发射波长处的光。优选PIK3CA 基因是 GenBank 登录号 NM_006218 版本号 NM_006218. 2GI :54792081可获得的序列，该序列通过参考整合在本专利技术中。当说明书中提到一个参照序列“3’末端6个核苷酸中至少4或5个”时，指所述参 照序列的所述6个核苷酸中的任意一个或两个核苷酸可能缺失或被不同的核苷酸取代。当 然，在一些实施方式中，该序列含有参照序列的全部6个核苷酸。在本说明书中，“ARMS”是例如EP-A-033M35中所公开的的扩增阻滞突变系统。当在本说明书中提到一种多核苷酸相对于参照多核苷酸的百分比时，这可以通过 本领域已知的算法确定。例如，两条序列之间的相同性百分数可以采用默认参数用BLASTP算法2. 2. 2版 (Altschul, Stephen F. , Thomas L. Madden,Alejandro A. Schaffer,JinghuiZhang,Zheng Zhang, Webb Miller，和 David J. Lipman (1997)，“缺口 BLAST 和 PSI-BLAST :新一代蛋白质 数据库检索程序”，核酸研究.25 =3389-3402)加以确定。附图说明图1显示了对含有突变PIK3CA基因的样品进行korpions检测和测序的结果。专利技术详述本专利技术的实施方式提供了可用于在含本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种多核苷酸，其特征在于，含有以下引物序列之一的３’末端的１０个核苷酸中至少７５％的核苷酸：ＳＥＱ．ＩＤ　ＮＯ：３－１６，１８，２０－３３，３５或３７－３９，或其互补序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.09.28 GB 0719034.11.一种多核苷酸，其特征在于，含有以下引物序列之一的3’末端的10个核苷酸中至少 75% 的核苷酸=SEQ. ID NO :3-16,18，20-33，35 或 37-39，或其互补序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸短于100个核苷酸，优选 短于80个核苷酸，更优选短于60个核苷酸，更优选短于40个核苷酸，更优选短于30个核苷酸。3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有以下引物序列 之一的3’末端12，14，16，17，18或20个核苷酸或整个序列中至少75%的核苷酸SEQ. ID NO :3-16,18，20-33，35 或 37-39，或其互补序列。4.如前任一权利要求所述的多核苷酸，其特征在于，还含有淬灭基团和荧光团。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述淬灭基团和荧光团由含有第一和 第二区域的核苷酸尾序列隔开，所述第一区域的核苷酸与所述第二区域的核苷酸互补但呈 反向，从而第一区域与第二区域的杂交导致所述淬灭基团与所述荧光团足够靠近，以淬灭 所述荧光团。6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述尾序列还包含具有与PIK3CA基因 的一个区域互补的序列的第三区域。7.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有SEQIDN0. 18的3， 末端的至少6个核苷酸并且所述尾序列含有SEQ. ID NO. 17。8.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有SEQIDN0.35的3’ 末端的至少6个核苷酸并且所述尾序列含有SEQ. ID NO. 34。9.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有SEQIDN0.39的3’ 末端的至少最后的核苷酸并且所述尾序列含有SEQ. ID NO. 38。10.如权利要求4-9任一所述的多核苷酸，其特征在于，所述淬灭基团含有Dabcyl。11.如权利要求4-10任一所述的多核苷酸，其特征在于，所述荧光团含有Hex，Fam或Rox ο12.含有前述权利要求之一所述的多核苷酸中的至少两条的试剂盒。13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有包含SEQIDN0. 18的多 核苷酸和包含SEQ ID NO. 3-16之一的多核苷酸；或含有包含SEQ ID NO. 35的多核苷酸和 包含SEQ ID N0. 20-33之一的多核苷酸；或含有包含SEQ ID N0. 39的多核苷酸和包含SEQ ID N0. 37的多核苷酸。14.如权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·宝德，J·弗格逊，P·F·帕维托，N·J·德尔威尔，D·怀特科比，
申请(专利权)人：DXS有限公司，
类型：发明
国别省市：GB