探测多核苷酸重复制造技术

本文提供了测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括用靶探测标签和重复探测标签标记扩增的靶核酸，靶探测标签不依赖于多核苷酸重复的数量，重复探测标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中两种类型的标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的靶探测标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的重复探测标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中该比率指示靶核酸中多核苷酸重复区域的长度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
所描述的方法一般涉及用于测定靶核酸中多核苷酸重复区域程度(extent)的试验。在具体方面，所描述方法涉及用于测定靶核酸中多核苷酸重复程度的试验，其中扩增的靶核酸用不依赖于多核苷酸重复数量的第一标签和与多核苷酸重复数量成比例的第二标签标记，以测定从标签探测的信号之间的比率，其指示多核苷酸重复数量。
技术介绍
人的若干体质性疾病的特征为在个体基因组的特定基因座上三核苷酸重复的扩增区域。该类型的两种最熟知的疾病为脆性X染色体综合征和亨廷顿病。在个体基因组的基因座处存在的三核苷酸重复数量与疾病的严重性相关。因此，已经开发了多种方法用于测定某些疾病相关基因的三核苷酸重复区域的长度。在脆性X中，重复基序是CGG。为诊断脆性X已经建立的临床方法是DNA印迹，其中来自个体的基因组DNA被限制性内切核酸酶消化以从基因组DNA中切除三核苷酸重复区域。该三核苷酸重复区域接着在琼脂糖凝胶上通过电泳按大小分开，印迹在膜上，并且用标记的对脆性X基因座特异性的探针探测该膜。 该方法使用电泳的按大小分开的能力测量重复区域的大小，并且是高劳动强度的、费时的， 且需要片段大小的主观解释。其他公开的用于测定三核苷酸重复区域长度的方法包括通过PCR扩增靶区域，然后通过使用测序工具的毛细管电泳评估大小。使用横跨重复区域的引物进行靶区域的PCR。 利用这些方法中最好的方法，已经优化PCR以扩增上至1，000或更多的重复。解释在常规平面凝胶上的电泳结果可具有挑战性。大小的读取是有些主观的，并且包括比较标准品和样品之间的偏差距离(excursion distance)——假设整个凝胶上没有明显的变形。一种PCR凝胶方法使用重复引物，其中引物是标靶的重复基序的全部或部分互补体(complement)。用重复引物产生的PCR产物的电泳产生成片条带(smear)；产物是许多不同长度的不同产物的混合物。解释这些重复引物PCR电泳图像是主观的。另一种公开的方法使用重复引物作为横跨引物(straddle primer)的替代物，在毛细管测序工具上进行高分辨率评估。尽管与平面电泳相比，结果的分辨率和清楚性被改善，但是解释可具有挑战性，尤其是在PCR打滑(PCR stutter)的情况中。利用毛细管测序工具作为读取机构的所有方法受到那些工具的高成本限制，并且受到它们的操作(比如环境温度范围)和维护要求非常严格的事实限制
技术实现思路
本文提供了测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括扩增包含多核苷酸重复区域的靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签和第二标签标记扩增的靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中第一标签和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示靶核酸中多核苷酸重复区域的长度。根据所描述方法的实施方式，结合扩增的靶核酸包括特异性杂交扩增的靶核酸与互补核酸捕获探针。任选地，第一标签并入在扩增靶核酸中使用的横跨引物。在进一步选项中，第二标签存在于在扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸中使用的核苷酸中或存在于与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针中。例如，与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针是与扩增的靶核酸中多核苷酸重复互补的核酸探针。根据本文提供的方法的实施方式，靶核酸分离自生物样品。术语“分离”指将核酸与天然发现核酸的环境的至少一些成分分开。因此，例如，分离的核酸可与细胞碎片分开。本文描述了其中靶核酸是基因组DNA的方法。生物样品获自个体对象，如，但不限于在本文描述的方法中使用的人对象。例如，根据本文描述的实施方式使用的生物样品获自具有选自下列的三核苷酸重复序列扩张疾病或处在具有选自下列的三核苷酸重复序列扩张疾病的风险下的个体对象 齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(dentatorubropallidoluysian atrophy)、亨廷顿病、脊延髓肌萎缩症(spinobulbar muscular atrophy)、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2型、脊髓小脑性共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调 7型、脊髓小脑性共济失调17型、脆性X染色体综合征；脆性XE智力迟钝；弗里德希氏共济失调；肌强直性营养不良；脊髓小脑性共济失调8型和脊髓小脑性共济失调12型。根据一些实施方式，本文描述的方法包括扩增参考核酸多核苷酸重复区域以产生扩增的靶参考核酸。这样的方法进一步包括用第一标签和第二标签标记扩增的靶参考核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例， 其中第一和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶参考核酸；将扩增的靶参考核酸结合至对扩增的靶参考核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第三信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第四信号；测定第三信号和第四信号的比率，其中比率指示靶参考核酸中多核苷酸重复区域的长度；并且比较第一信号和第二信号的比率与第三信号和第四信号的比率。第一信号和第二信号的比率与第三信号和第四信号的比率的比较使得能够探测第一核酸多核苷酸重复区域与参考的不同，所述第一核酸多核苷酸重复区域如包含来自具有三核苷酸重复序列扩张疾病或处在具有三核苷酸重复序列扩张疾病的风险下的个体对象的多核苷酸重复区域的样品基因组DNA。任选地，进一步包括的是扩增包含第二多核苷酸重复区域的第二靶核酸以产生扩增的第二靶核酸；用第一标签和第二标签标记扩增的第二靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将扩增的第二靶核酸结合至对扩增的第二靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示第二靶核酸中多核苷酸重复的长度。任选地，第二编码的基底是多个编码的颗粒，产生第二颗粒组。根据一些实施方式，第一和第二颗粒组在将扩增的第一和第二靶核酸结合至第一和第二编码的基底期间一起在反应器中存在。测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签标记扩增的靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的第一捕获探针；扩增靶核酸以产生多核苷酸重复区域核酸；用第二标签标记多核苷酸重复区域核酸，第二标签与多核苷酸重复的数量成比例； 将多核苷酸重复区域核酸结合至对多核苷酸重复区域核酸特异性的第二捕获探针；探测与第一捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与第二捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度。任选地，第一和第二捕获探针相同。在进一步实施方式中，第一和第二捕获探针不同。筛选遗传条件(genetic condition)的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法，其包括扩增获自个体的样品的靶核酸以产生扩增的靶核酸，其中扩增的靶核酸包含第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·小阿德勒，
申请(专利权)人：珀金埃尔默健康科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：