涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法技术

本发明专利技术的名称是涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法。提供了方法，其包括适合于检测酶比如溶酶体贮积酶的活性的添加剂化合物，其中所述添加剂是油酸的盐。包括油酸的盐出人意料地改善了酶活性和再现性。善了酶活性和再现性。善了酶活性和再现性。

【技术实现步骤摘要】
涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2015年9月2日、申请号为2015800581144、专利技术名称为“涉及测试溶酶体贮积紊乱的方法”。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请依赖于2014年9月2日提交的美国专利申请号14/474,524并要求其优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。


[0004]本说明书涉及用于检测酶活性的分析试剂。提供了溶酶体酶活性的检测，其可以被用于检测一种或多种溶酶体贮积紊乱的筛选测定。

技术介绍

[0005]溶酶体贮积紊乱是特征在于体内缺乏特定酶的一组遗传性紊乱，其导致身体不能分解代谢物质。作为实例，法布里病是在每40,000人中有1人发病的溶酶体贮积紊乱。其由酶α
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半乳糖苷酶的缺乏引起，这导致身体不能分解被称为球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂肪物质。第二个实例是高歇病，一种由不能分解脂肪物质或脂质——被称为葡糖苷酰鞘氨醇类(也被称为葡糖脑苷脂类)——引起的溶酶体贮积紊乱。患有高歇病的个体不能制造葡糖脑苷脂酶——一种分解这些脂肪物质需要的酶。这些脂肪物质然后在肝细胞、脾细胞和骨髓细胞中累积。第三个实例是蓬珀病，一种由酶酸性α
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葡糖苷酶——其在分解被称为糖原的某些糖类中是需要的——的缺乏引起的溶酶体贮积紊乱。当酶酸性α
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葡糖苷酶缺失时，糖原在体内的各个组织和器官中累积。
[0006]在极大程度上，溶酶体贮积紊乱是儿童紊乱，但是在成年人中也会展现一些。在他们的大多数中，患者在出生时是正常的并且在随后的一些时间开始患有进行性神经恶化。临床表型取决于生化缺陷的类型和严重性。这些溶酶体紊乱中的一些，比如蓬珀病和克腊比病，主要在婴儿期展现。在开发在临床症状的开始之前检测这些紊乱使得治疗性干预可以发起的方法中存在着持续的努力。
[0007]大多数目前提供的用于溶酶体贮积紊乱(LSD)的筛选测试基于由Zhang等(Methods Mol Biol.2010；603:339
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350)描述的质谱法和材料。该方法，对于六种LSD(蓬珀病、克腊比病、尼
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皮二氏病A&B、法布里病、高歇病和MPS
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1)，使用六种不同的条件在六个不同的器皿中进行六种酶活性测定。已经描述了用于相同紊乱的多重测定(Scott等，J Pediatr.2013年8月；163(2):498
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503；Spazil等，Clin Chem.2013年3月；59(3):502
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11)。多重方法需要较少的实验室劳动和试剂，但是产生与非多重方法类似质量的测定结果通常是更困难的，在该非多重方法中测定条件需要代表支持目标酶的足够活性同时抑制任何混淆过程的折衷(compromise)。各种酶活性增强剂和抑制剂被添加至多重缓冲液以支持优化条件，其使得目标酶中的每一种可测量地作用于其特异性人工底物。
[0008]油酸已经被鉴定为GALC酶的增强剂，GALC酶的低活性与克腊比病相关联(Zhang等，同上；Zhang等，Clin Chem.2008；54(10):1725
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1728；Li等，Clin Chem.2004；50(10):
1785
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1796)。该酸已经被加入到缓冲液中用于克腊比病筛选。但是，油酸在水性缓冲液中溶解是非常困难的，并且在测定缓冲液中得到的不同浓度已经导致测定结果具有差的再现性。由于该原因，用于克腊比病筛选的大多数出版的方案省略了油酸，因为再现性问题超过来自增强的酶活性的任何潜在性能优势。
[0009]因此，对于改善用于检测溶酶体紊乱的方法和组合物存在持续的需求。

技术实现思路

[0010]提供下面的
技术实现思路
以促进对所提供方法特有的创新特征中的一些的理解，并且
技术实现思路
不意欲是充分描述。方法的各个方面的充分理解可以通过将整个说明书、权利要求书、附图和摘要作为整体来获得。
[0011]提供了使用检测系统比如质谱法检测酶反应的改善的组合物和方法。这些组合物和方法提供了与目标酶的改善的反应性，从而改善了测定效率、再现性和准确性。
[0012]提供了包括在可用于评估样本中溶酶体酶活性水平的测定中的化合物。溶酶体酶活性的测试是有用的，例如，当筛选新生儿中的代谢紊乱时，以及当评估患有影响酶活性的医学病症的个体或者经历医学治疗比如酶替代疗法、基因疗法或骨髓移植的个体时。如本文所描述，使用油酸盐或油酸烷基酯改善了针对合成底物的目标酶活性。
[0013]本专利技术的一个目标是提供一种或多种添加剂至适合于检测酶——说明性地是其缺乏导致溶酶体贮积紊乱的酶——活性的反应。添加剂任选地是油酸的盐，任选地油酸钠。添加剂任选地是油酸烷基酯，任选地油酸甲酯。一种或多种添加剂任选地在测定过程之前被加入至测定的一种或多种组分进行储存，或者任选地作为可溶性材料被加入至测定。因此，提供了如此方法，其用于检测酶的存在、不存在或水平，或用于检测对象中存在或不存在酶缺乏。酶任选地是酶缺乏导致溶酶体贮积紊乱的酶。在用于检测酶的存在、不存在或水平的方法中使用油酸盐或油酸烷基酯使得测定结果中改善的置信度，其来自由于添加剂而实现的改善的反应性和再现性。用于检测酶活性的方法包括将包含目标酶的样本与底物和添加剂在其中目标酶能够作用于底物以产生酶产物的条件下接触；和检测酶产物。任选地，所述目标酶是酸性β
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葡糖脑苷脂酶、酸性半乳糖脑苷脂β
‑
半乳糖苷酶或酸性
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β
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葡糖脑苷脂酶。
[0014]检测的步骤任选地是通过质谱法，或任选地通过多反应监测比如在MS/MS中。检测的步骤任选地是通过免疫测定、底物裂解荧光测定(substrate cleavage fluorescence assay)、HPLC、质谱法、或其它适合的用于检测具有低于1000道尔顿的分子量的分子的方法。
附图说明
[0015]图1图解了在方法的一些实施方式中使用的示例性底物和内标物；
[0016]图2图解了当使用低的酶对照样本时加入和不加入油酸钠的情况下获得的酶活性；
[0017]图3图解了当使用中等的酶对照样本时加入和不加入油酸钠的情况下获得的酶活性，其中柱1代表ABG，柱2代表ASM，柱3代表GALC，柱4代表IDUA，柱5代表GLA和柱6代表GAA；
[0018]图4图解了当使用高的酶对照样本时加入和不加入油酸钠的情况下获得的酶活
性，其中柱1代表ABG，柱2代表ASM，柱3代表GALC，柱4代表IDUA，柱5代表GLA和柱6代表GAA；和
[0019]图5图解了加入和不加入油酸钠的情况下获得的比率(中等的对照DBS/低的对照DBS)，其中柱1代表ABG，柱2代表ASM，柱3代表GALC，柱4代表IDUA，柱5代表GLA和柱6代本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的用于体外测定酶活性的方法，其包括：将包含目标酶的样本与底物和一种或多种油酸盐接触，其中所述油酸盐选自油酸钠、油酸钾、油酸镁、油酸钙、油酸锌、油酸锂或其组合，所述接触步骤在其中所述目标酶能够作用于所述底物以产生酶产物的条件下；和检测所述酶产物，其中所述目标酶是酸性α
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半乳糖苷酶A、酸性β
‑
葡糖脑苷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α
‑
葡糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α
‑
L
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【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：珀金埃尔默健康科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：