一种微液滴生物传感器的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种微液滴生物传感器，微液滴中含有产酶菌、检测菌和底物，检测菌采用注射方式注射入培养后的含有产酶菌的微液滴中，保证检测菌与产酶菌的浓度相当且相对稳定，其中，检测菌可以且只可以利用氨基葡萄糖，激活生产荧光蛋白，从而根据微液滴中的荧光强度对氨基葡萄糖的浓度进行检测。本方法可用于液滴高通量筛选，可以极大的提升对产酶菌株的改造和对酶定向进化的效率。和对酶定向进化的效率。和对酶定向进化的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种微液滴生物传感器的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及高通量检测领域，尤其涉及一种微液滴生物传感器的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]氨基葡萄糖是一种广泛存在于自然界的小分子单糖，在医药和保健品等领域有广泛的应用。目前，工业上生产氨基葡萄糖主要采用化学水解法，此方法以虾蟹壳中的甲壳素为底物，使用强酸进行水解，反应条件苛刻、易造成环境污染且生产效率有限。随着绿色化学、环保制造的提倡，更多的研究开始关注绿色环保的微生物发酵技术，并以甲壳素、葡萄糖等廉价产品为底物，通过水解或合成等方式生产氨基葡萄糖。其中，己丁二糖脱乙酰酶可以将相对廉价的N
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乙酰氨基葡萄糖脱乙酰水解，得到氨基葡萄糖。
[0003]然而，现有的通过微生物胞外表达己丁二糖脱乙酰酶仍然存在表达量有限的问题；同时，己丁二糖脱乙酰酶自身的催化活性也需要提升。针对这两方面的问题，我们需要对表达己丁二糖脱乙酰酶重组菌株进行工程改造，以及对酶本身进行定向进化。然而，这两种改造方式往往会涉及到对上万乃至百万数量的突变进行筛选，挑选出具有更高氨基葡萄糖产量的重组菌株或者酶突变体。传统的基于96孔板的检测方法由于通量过低、试剂消耗量大等缺陷，已难以满足筛选的需求。
[0004]现有的高通量筛选方法主要有流式细胞筛选和液滴微流体筛选。在流式细胞筛选中，所有细胞处于共同的培养环境，无法区分来自不同细胞的胞外分泌物，因而不适用于检测氨基葡萄糖。而液滴微流体筛选通过制作液滴，在包裹细菌的同时提供了化学屏障，阻碍不同液滴间的化学交流，非常适合检测酶法生产氨基葡萄糖的产量并进行筛选，其筛选速度可以达到每秒数千液滴，远超于传统的96孔板实验。马富强(微液滴酶反应器超高通量筛选体系的建立，上海交通大学，2016)提出一种基于微流控芯片的“水
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油”微反应器双色荧光分选体系，但采用直接将产酶菌和检测菌包入液滴培养并检测荧光的方法难以保证比例，且检测菌可能影响产酶菌的生长。因此，仍需一种筛选通量高，可对大量突变和改造样本进行检测分析的方法。目前还没有研究报道可在液滴中有效检测氨基葡萄糖的方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术针对产酶菌株的工程改造和酶的定向进化过程中出现的大量突变体，提供一种适用于微液滴高通量筛选的生物传感器，实现对微液滴中氨基葡萄糖产量的检测，从而解决现有对氨基葡萄糖检测方法无法适用于液滴高通量筛选的问题。
[0006]本专利技术的一种微液滴生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
[0007](1)将产酶菌培养并稀释至浓度为3
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10百万个菌/mL，将稀释后的产酶菌包裹进微液滴中，培养，得到含有产酶菌的微液滴，其中，产酶菌为可表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株；
[0008](2)向检测菌培养液中加入N
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乙酰氨基葡萄糖，得到检测菌溶液，其中，检测菌为
只可以利用氨基葡萄糖激活生产荧光蛋白的菌株；
[0009](3)将步骤(2)的检测菌溶液注射入步骤(1)的含有产酶菌的微液滴中培养，得到微液滴生物传感器，其中，按照单个微液滴中检测菌和产酶菌的数量比为1:0.8
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1.2注射检测菌。
[0010]本专利技术包裹产酶菌时采用平均10个微液滴仅有1个包有单菌的策略，保证单细胞包裹率，避免多细胞包裹。同时采用注射法注射检测菌，注射时，液滴流速和注射的水相(含有检测菌、底物、IPTG诱导剂、培养基等)流速比约为1：0.8(由于液滴包含滴液内的的水和液滴外的油，此比例下水相混合比约为1：1)，可控制检测菌注射入微液滴的数量，培养过后的产酶菌与之有相近的细胞浓度，以此保证微液滴中产酶菌和检测菌的数量比约为1:1且相对稳定。微液滴生物传感器将产酶菌与检测菌共培养，再加入底物进行氨基葡萄糖浓度的检测。
[0011]进一步地，微液滴的直径为20
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50μm，优选为30μm。
[0012]进一步地，产酶菌为枯草芽孢杆菌。
[0013]进一步地，检测菌为枯草芽孢杆菌。
[0014]进一步地，检测菌由以下步骤构建得到：
[0015]敲除Bacillus subtilis 168的基因gamR、nagB和gamA，将敲除后的基因转入质粒pHTcsg2，得到重组表达载体，转入宿主细胞，得到检测菌。
[0016]进一步地，注射检测菌溶液的具体步骤为：
[0017]配制含有检测菌、底物N
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乙酰氨基葡萄糖、诱导剂IPTG以及TB培养基的溶液，收集溶液于注射器中，通过液滴注射芯片将检测菌溶液注射进含有产酶菌的液滴中。
[0018]进一步地，在步骤(1)中，稀释后的产酶菌包裹进微液滴后培养8
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36h，优选为24h。目的是使产酶菌达到与检测菌相应的细胞浓度。
[0019]进一步地，在步骤(2)中，检测菌溶液中N
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乙酰氨基葡萄糖的浓度为8
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12g/L。检测菌生产的荧光蛋白与氨基葡萄糖浓度呈线性相关，线性响应范围约为0
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1g/L，注射的底物浓度在此范围内，保证注射后底物浓度为4
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6g/L，浓度不至于过高导致荧光达到上限或过低导致荧光信号区分不明显。
[0020]进一步地，在步骤(3)中，培养18
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30h，优选为24h。目的是保证检测菌能够表达与氨基葡萄糖浓度相应数量的荧光蛋白。
[0021]进一步地，在步骤(1)
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(3)中，于30
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40℃培养，优选为37℃。
[0022]本专利技术的一种上述构建方法构建的微液滴生物传感器。
[0023]本专利技术要求保护上述微液滴生物传感器在筛选己丁二糖脱乙酰酶的重组菌株或突变体，或在氨基葡萄糖高通量检测中的应用。
[0024]本专利技术的产酶菌分解底物N
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乙酰氨基葡萄糖得到产物氨基葡萄糖，检测菌可以且只可以利用产物氨基葡萄糖，而无法利用作为底物的N
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乙酰氨基葡萄糖，从而激活检测菌生产荧光蛋白，根据微液滴生物传感器的荧光强度进行高通量筛选或检测，氨基葡萄糖浓度越高，荧光强度越强。
[0025]进一步地，通过液滴微流体高通量筛选系统进行筛选，具体步骤为：
[0026]将培养过后的含有产酶菌、检测菌及底物的微液滴重新注入筛选芯片，进行高通量微液滴筛选。
[0027]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0028](1)本专利技术首次提出在微液滴中进行氨基葡萄糖的检测，实现了高通量检测或筛选，可极大提升产酶菌株的改造和对酶定向进化的效率。
[0029](2)本专利技术的微液滴生物传感器在高通量筛选或检测的基础上，可以较好地响应不同浓度的氨基葡萄糖以及氨基葡萄糖不同产量的产酶菌，从而实现氨基葡萄糖的浓度检测以及高产菌的筛选。
[0030]上述说明仅是本专利技术技术方案的概本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微液滴生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将产酶菌培养并稀释至浓度为3
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10百万个菌/mL，将稀释后的产酶菌包裹进微液滴中，培养，得到含有产酶菌的微液滴，其中，所述产酶菌为可表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株；(2)向检测菌培养液中加入N
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乙酰氨基葡萄糖，得到检测菌溶液，其中，所述检测菌为只可以利用氨基葡萄糖激活生产荧光蛋白的菌株；(3)将步骤(2)的检测菌溶液注射入步骤(1)的含有产酶菌的微液滴中培养，得到所述微液滴生物传感器，其中，按照单个微液滴中所述检测菌和产酶菌的数量比为1:0.8
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1.2注射检测菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述微液滴的直径为20
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50μm。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述产酶菌为枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述检测菌为枯草芽孢杆菌。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，孙国运，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：