一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法技术

本发明专利技术涉及一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，包括：取新生儿脐带，磷酸缓冲液冲洗干净；脐带粉碎；将粉碎后脐带过粗滤网及２００目滤网，获得直径为１－１．５ｍｍ脐带组织块；沥干后，将脐带组织块接种于培养皿中；培养皿放于５％ＣＯ２、３７℃培养箱内，三小时后；加入含２０％牛血清、１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ的Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培养液，放回培养箱，五天后；将胰蛋白酶加入培养皿中，干细胞入消化液；消化液经２００目滤网过滤；将滤液离心，去除上清，获得脐带组织间充质干细胞。本发明专利技术操作更简便，保持细胞原有活性及生长状态，提高ＭＳＣｓ得率，避免胶原酶对干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其特征在于，该方法是由下述步骤组成：（１）首先取新生儿的脐带，由８ｇ的ＮａＣｌ、０．２ｇ的ＫＣ１、１．１５ｇ的Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］、０．２ｇ的ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］用水定容为１Ｌ的方法制作而成磷酸缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；（２）将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；（３）再将获得的脐带组织块滤过孔径１．５ｍｍ的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于１．５ｍｍ的小脐带组织块；（４）再将获得的小脐组织带块滤过２００目滤网，收集２００目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带组织块，获得直径为１－１．５ｍｍ多个脐带组织块；（５）直径为１－１．５ｍｍ脐带组织块在２００目滤网上沥干液体后，将２００目滤网上脐带组织块接种于细胞培养皿中；（６）不加培养液，直接放置于５％ＣＯ↓［２］、３７℃培养箱内，静置三小时；（７）然后加入含２０％牛血清、１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ的Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培养液５ｍＬ，置于５％ＣＯ↓［２］、３７℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到８０％融合；（８）胰蛋白酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量５ｍＬ，吸弃洗液，吸取１ｍＬ的含０．２５％胰蛋白酶和０．１％ＥＤＴＡ的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化３－５分钟，再将５ｍＬ含了２０％牛血清、１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ的Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；（９）消化液经２００目滤网过滤，去掉脐带组织块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；（１０）将滤液在９００ｒｐｍ下离心５分钟，去除上清，使用３ｍＬ的Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ１２培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘拥军，刘广洋，徐萌，
申请(专利权)人：和泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11