本发明专利技术公开了一种新的基于ＶＰＡ诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，是以人的骨髓为原料，分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸ＶＰＡ处理后，依次加入成纤维细胞生长因子４、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化，得到一类具有合成糖元、尿素和分泌白蛋白等肝细胞生物学功能，且具有双核、多边形的肝细胞样细胞。本发明专利技术的方法大幅度提高了人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的效率，不仅为人骨髓间充质干细胞开发应用于肝脏疾病的细胞移植治疗以及开展肝组织工程等提供了新技术和开辟了新的途径，而且也为肝细胞分化发育分子机制包括表观遗传机制等的研究提供了新的研究模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，涉及发现一种基于组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid， VPA)诱导人骨髓间充质干细胞(humanbone marrow mesenchymal stemcells, hB匪SCs)体外跨越分化肝细胞的技术。
技术介绍
干细胞(Stem cell)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，根据其发育阶段的不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞广泛存在于骨髓、神经、肌肉、表皮、肠、肝等组织或器官。传统观点认为成体干细胞只可向其定居的组织类型分化，而不能分化成其他组织类型的细胞。但近年来研究表明，成体干细胞在一定条件下可分化为与其所在组织不同的其他组织类型细胞，这被称为成体干细胞的可塑性。成体干细胞这一潜能的发现，大大拓宽了其在临床医学治疗上的应用前景，如鉴于成体干细胞的跨越分化潜能，利用成体干细胞定向诱导分化技术，可以将来源于不同组织的成体干细胞分化成所需组织的细胞，如利用造血干细胞，不仅能重建患者的造血及免疫功能，还能在患者体内分化成各种成熟的非造血组织细胞，如心肌细胞、肝细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞等，这些细胞可以有机地整合到相应的组织和器官中，修复或替换患者丧失功能或受损的组织和器官。 慢性肝炎、肝硬化、门静脉高压病、原发性肝癌、遗传性及代谢性肝脏疾病等诸多难治性肝病已成为全世界共同面临的棘手问题，我国每年因肝病死亡的患者约50万人。当前，对于肝功能衰竭(如肝坏死、肝硬化等)和肝脏相关的遗传性疾病的治疗主要依赖于原位肝移植，但供体肝来源严重不足和移植排斥等问题限制了这一治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓解上述问题，但其来源细胞同样也面临着存活期短，特别是随着培养时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻找合适的肝细胞来源已成为一个十分紧迫的课题。而利用成体干细胞跨越分化为肝细胞无疑是解决这一问题的一个有效途径，因此这方面的研究也成为当前干细胞以及肝病细胞治疗的研究热点之一。 通常B匪SCs能够分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，但近年来很多研究证明B匪SCs在体内或体外有向多种细胞系分化的潜能，例如表皮样细胞、神经细胞和肝细胞。B匪SCs的这些特性对于它们在将来应用时，能够避开很多障碍，例如利用自体B匪SCs定向分化的细胞进行移植，可以避免生物伦理学问题以及免疫排斥的风险，使得其能够作为组织工程和细胞移植治疗的一个很好的选择。然而建立有效的B匪SCs向肝细胞体外分化方案是关键。近年来，研究者利用大鼠和小鼠等实验动物模型，对BMMSCs体外分化肝细胞进行了较多的研究，并初步建立了一些分化诱导技术，如利用小鼠损伤肝脏组织条件培养液和胎肝组织条件培养液诱导小鼠B匪SCs体外分化肝细胞的技术，利用不同的细胞因子(如SCF、HGF、EGF和FGF-4等)组合诱导分化技术等，但关于人B匪SCs分化肝细胞的研究尚不多见，而且研究工作大多集中在建立不同的细胞因子组合诱导分化，尚未见利用组蛋白去4乙酰化酶抑制剂VPA诱导其分化肝细胞的技术体系。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是建立一种能较大幅度提高人骨髓间充质干细胞(hB匪SCs)体外分化肝细胞的新技术。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种通过调控组蛋白乙酰化表观遗传修饰促进肝细胞分化调控基因表达，从而实现肝细胞分化效率的技术。其中对组蛋白乙酰化修饰的调控通过使用组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases，HDACs)抑制剂VPA来实现，作为本专利技术方法的改进，在使用VPA预处理hB匪SCs后，再组合成纤维细胞生长因子4(FGF4)、肝细胞生长因子(HGF)、抑瘤素(0SM)细胞因子进行诱导，以促进hBMMSCs向肝细胞的早期分化和后期成熟。 为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下方法来实现的 —种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA处理后，依次加入FGF4、 HGF和OSM和Dex，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤 (1)骨髓间充质干细胞的分离与制备； (2)进行VPA预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化； (3)分化肝细胞的鉴定。 所述的步骤(1)中的分离与制备包括如下步骤 a)从成年健康自愿者获取骨髓； b)用密度梯度离心法分离其中的单个核细胞； c)用差异生长贴壁法纯化单个核细胞中的间充质干细胞。 所述的步骤a)中的原料取自成年健康自愿者的骨髓，并加入肝素抗凝剂，肝素抗凝剂剂量为10. 0 12. 5IU/ml血液。 所述的步骤b)中单个核细胞通过下述方法获得用磷酸盐缓冲的生理盐液(PBS，PH7.0)将从步骤a)中获取的骨髓洗涤2次，并将骨髓稀释成细胞悬液，加至人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque，D= 1.077±0. 002g/ml)上层，室温2200rpm/min离心25分钟后，取中间白色细胞层(单个核细胞层)，加入基础培养液洗涤细胞，然后1000rpm低速离心6 7分钟，弃上清，得到人的骨髓单个核细胞。 所述的步骤c)是将经过步骤b)得到的骨髓单个核细胞用含10% FBS的基础培养液重新悬浮后，按4X10Vcm2密度接种于一次性塑料培养瓶，置37°C，5% C02培养箱中培养，48h后倒去培养液，用PBS冲洗两次，弃去未贴壁的细胞，加入新鲜基础培养液继续培养，当原代培养细胞覆盖培养瓶底面积约70% 90%时，用0. 25%胰蛋白酶消化收集细胞，通过有限稀释法接种在孔板中，此时为第一代的干细胞(PI);每3天更换新鲜基础培养液，选取形态均一、生长良好的细胞，用胰酶消化收集细胞，继续进行传代培养，得到含有单一纯化的hB匪SCs。本实验中后期用于诱导的干细胞为第三代到第七代的干细胞(P3 P7)。 所述的步骤(2)中的诱导培养细胞是将经过步骤(1)处理后得到的含有单一纯化的人骨髓间充质干细胞的基础培养液中加入诱导物；诱导物采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA以及含有细胞因子的培养液；首先加入VPA预处理72小时后，去除含有丙戊酸的培养液，加入含有细胞因子的培养液，所述的细胞因子分别为FGF4、HGF、0SM和Dex，此加入顺序类似于肝脏个体发育过程中细胞因子的分泌顺序；其中含有细胞因子的培养液是指将细胞因子均先按照比例加入到基础培养基里得到；每三天换上述培养液，分别诱导培养至7天，14天和21天，得到基于VPA诱导的hB匪SCs体外分化的肝细胞，然后进行肝细胞分化的鉴定。 所述的细胞因子的加入量分别是5mM VPA、 (mM指mmol/l)20ng/ml FGF4、30ng/mlHGF、20ng/ml OSM禾口 40 ii g/ml Dex。 所述的步骤(3)中的肝细胞分化的鉴定包括形态学观察、肝细胞特异性基因及蛋白表达(RT-PCR)分析、细胞糖原合成能力检测、尿素合成功能检测、白蛋白分泌功能检测、细胞色素P450活性检测、细胞诱导组蛋白H3和H4的免疫荧光检测和特异性蛋白印记(westernblot)检测。 组蛋白乙酰化是最早发现的与转录有关的组蛋白修饰方式之一。组蛋白末端的乙酰化状态本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于ＶＰＡ诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸处理后，依次加入成纤维细胞生长因子４、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤： （１）骨髓间充质干细胞的分离与制备； （２）进行丙戊酸预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化； （３）分化肝细胞的鉴定。
【技术特征摘要】
一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸处理后，依次加入成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤(1)骨髓间充质干细胞的分离与制备；(2)进行丙戊酸预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化；(3)分化肝细胞的鉴定。2. 如权利要求1所述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤(1)中的分离与制备包括如下步骤a) 从成年健康自愿者获取骨髓；b) 用密度梯度离心法分离其中的单个核细胞；C)用差异生长贴壁法纯化单个核细胞中的骨髓间充质干细胞。3. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤a)中的原料取自成年健康自愿者的骨髓，并加入肝素抗凝剂， 肝素抗凝剂剂量为10. 0 12. 5IU/ml血液。4. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤b)中单个核细胞通过下述方法获得用磷酸盐缓冲的生理盐液 将从步骤a)中获取的骨髓洗涤2次，并将骨髓稀释成细胞悬液，加至人淋巴细胞分离液上 层，室温2200rpm/min离心25分钟后，取中间单个核细胞层，加入基础培养液洗涤细胞，然 后1000rpm低速离心6 7分钟，弃上清，得到人的骨髓单个核细胞。5. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤c)是将经过步骤b)得到的骨髓单个核细胞用含10% FBS的基 础培养液重新悬浮后，按4X 10Vcm2密度接种于一次性塑料培养瓶，置37°C ， 5% C02培养箱 中培养，48...
【专利技术属性】
技术研发人员：董学君，邵健忠，项黎新，张卉，杨超，
申请(专利权)人：绍兴市人民医院，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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