一种基于ＶＰＡ诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种新的基于ＶＰＡ诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，是以人的骨髓为原料，分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸ＶＰＡ处理后，依次加入成纤维细胞生长因子４、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化，得到一类具有合成糖元、尿素和分泌白蛋白等肝细胞生物学功能，且具有双核、多边形的肝细胞样细胞。本发明专利技术的方法大幅度提高了人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的效率，不仅为人骨髓间充质干细胞开发应用于肝脏疾病的细胞移植治疗以及开展肝组织工程等提供了新技术和开辟了新的途径，而且也为肝细胞分化发育分子机制包括表观遗传机制等的研究提供了新的研究模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及发现一种基于组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid， VPA)诱导人骨髓间充质干细胞(humanbone marrow mesenchymal stemcells, hB匪SCs)体外跨越分化肝细胞的技术。
技术介绍
干细胞(Stem cell)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，根据其发育阶段的不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞广泛存在于骨髓、神经、肌肉、表皮、肠、肝等组织或器官。传统观点认为成体干细胞只可向其定居的组织类型分化，而不能分化成其他组织类型的细胞。但近年来研究表明，成体干细胞在一定条件下可分化为与其所在组织不同的其他组织类型细胞，这被称为成体干细胞的可塑性。成体干细胞这一潜能的发现，大大拓宽了其在临床医学治疗上的应用前景，如鉴于成体干细胞的跨越分化潜能，利用成体干细胞定向诱导分化技术，可以将来源于不同组织的成体干细胞分化成所需组织的细胞，如利用造血干细胞，不仅能重建患者的造血及免疫功能，还能在患者体内分化成各种成熟的非造血组织细胞，如心肌细胞、肝细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞等，这些细胞可以有机地整合到相应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ＶＰＡ诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸处理后，依次加入成纤维细胞生长因子４、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤：　　（１）骨髓间充质干细胞的分离与制备；　　（２）进行丙戊酸预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化；　　（３）分化肝细胞的鉴定。

【技术特征摘要】
一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸处理后，依次加入成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤(1)骨髓间充质干细胞的分离与制备；(2)进行丙戊酸预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化；(3)分化肝细胞的鉴定。2. 如权利要求1所述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤(1)中的分离与制备包括如下步骤a) 从成年健康自愿者获取骨髓；b) 用密度梯度离心法分离其中的单个核细胞；C)用差异生长贴壁法纯化单个核细胞中的骨髓间充质干细胞。3. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤a)中的原料取自成年健康自愿者的骨髓，并加入肝素抗凝剂， 肝素抗凝剂剂量为10. 0 12. 5IU/ml血液。4. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤b)中单个核细胞通过下述方法获得用磷酸盐缓冲的生理盐液 将从步骤a)中获取的骨髓洗涤2次，并将骨髓稀释成细胞悬液，加至人淋巴细胞分离液上 层，室温2200rpm/min离心25分钟后，取中间单个核细胞层，加入基础培养液洗涤细胞，然 后1000rpm低速离心6 7分钟，弃上清，得到人的骨髓单个核细胞。5. 如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方 法，其特征在于所述的步骤c)是将经过步骤b)得到的骨髓单个核细胞用含10% FBS的基 础培养液重新悬浮后，按4X 10Vcm2密度接种于一次性塑料培养瓶，置37°C ， 5% C02培养箱 中培养，48...

【专利技术属性】
技术研发人员：董学君，邵健忠，项黎新，张卉，杨超，
申请(专利权)人：绍兴市人民医院，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]