人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术公开的人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法，包括：采集脂肪；获取和分离人脂肪成体干细胞；培养人脂肪成体干细胞；检测、冻存人脂肪成体干细胞；建库。利用本发明专利技术的获取人脂肪成体干细胞的方法，可有效的分离、纯化、扩增脂肪成体干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立长期存储人脂肪干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量干细胞资源。根据获取的人脂肪成体干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，该库为健康成人储存脂肪干细胞，为其本人在罹患需要采用干细胞移植时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的干细胞用于干细胞制剂的生产。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞获取方法及其干细胞库构建的方法，尤其涉及一种人脂肪成体 干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法。干细胞研究是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是一类 具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。近几年研究表明，成 体干细胞的分化能力远超过传统观点所局限的范围。因此目前干细胞的应用已经不再局限 于利用胚胎干细胞的全能性去研究组织细胞再生，也不再局限只用组织本身的起始干细胞 做细胞治疗研究，而是趋于寻找更多的干细胞来源，通过研究他们的分化潜能，扩增能力， 分化后的细胞功能以及取材是否安全方便等问题，选择最合适的干细胞源来进行组织细胞 再生修复。最近研究证明，在来源于成体脂肪组织中的有核细胞中，像骨髓一样也含有一种 多能干细胞，国际上把这种细胞命名为脂肪来源干细胞(英文全称Adipose Derived Stem Cells，简称ADSCs)。这种细胞群易分离，并像骨髓中的间充质干细胞那样在特定条件下可 分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等。许多研究表明，已有从人或 其他物种上分离出来ADSCs，并且ADSCs的表面抗原与骨髓间充质干细胞基本类似。直接 比较人的ADSCs和间充质干细胞的表面抗原，约多于90%都是一致的。实验表明，ADSCs像 骨髓源性的间充质干细胞一样，经体外扩增后，其具有较低的免疫原性和免疫调节功能。这 就表明ADSCs不会在体内引起T细胞(即胸腺依赖淋巴细胞)的细胞毒性反应。移植同种 异基因ADSCs将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提 供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获 得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成为目前研究的 新热点，不论在再生医学还是基因治疗方面都具有重大的应用潜力。为了便于人们有效储存和使用干细胞资源，目前在世界范围内，已经建立了多个 干细胞库。所谓干细胞库是在约为_196°C液氮中(深低温)储存干细胞及搜集存储干细 胞资源相关资料的场所。按所储存的干细胞来源和采集方式，干细胞库主要可分为胚胎干 细胞库、成体干细胞库以及病理细胞库，成体库中包括脐血干细胞库、骨髓和外周血干细胞 库、以及脐带间充质干细胞库。一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞 提供临床使用的能力。目前尚无脂肪成体干细胞库，因此，构建脂肪成体干细胞库，将人健 康时的脂肪干细胞通过本专利技术建立的系统工程技术储存建库，是将现有资源充分利用的有 效方法，为存储本人、家属和他人在需要采用脂肪成体干细胞移植及相关技术治疗的各种 疾病时，提供临床适用型脂肪成体干细胞，其应用前景十分广阔。本专利技术的目的在于克服以上技术的不足，而提供一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本专利技术的另一目的在于克服以上技术的不足，而提供一种人脂肪成体干细胞库的 构建方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本专利技术提供的一种人脂肪成体干细胞的获取方法，包括(1)采集脂肪对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体 检HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；(2)获取和分离人脂肪成体干细胞取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血 管和纤维部分，用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂 肪组织绞碎为l_2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0. 2%胶原酶磷酸缓冲液消化，在 37°C温度条件下均勻震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速 离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复 吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分 钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；(3)培养人脂肪成体干细胞将获得的干细胞按1-2 X IOVcm2接种于培养瓶，加入 IOmL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37°C、CO2含量为5%的培养箱中培养， 4-5天后更换新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3_4天 更换含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加 0. 25%胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37°C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞， 用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15%胎牛血 清的高糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞 悬液移入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清， 向离心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混勻细胞，获得培养 后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37°C、CO2含量为5%的培养箱中培 养，即按1 3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞人脂肪成体干细胞的检测步骤为用IOmL的 D-Hank' s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTAj^A 37°C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶 确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用 微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6X IO6个 细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存，将两管细胞以900转/分钟 离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混勻，送入药品非临床研 究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表 型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合 格标准；冻存步骤为向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2X106细胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上 同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1 1比例加入到冻存管内混合， 先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时 有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不 合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由专门人员运走处理。优选的，所述步骤(2)中用镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。所述步 骤(2)中用无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。所述步骤(2)中胶原酶磷酸缓冲液消化，在37°C 温度条件下消化时间为60分钟。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，包括：（１）采集脂肪：对供者进行ＡＢＯ／Ｒｈ血型检测、ＨＬＡ分型的检测、微生物免疫检测，体检ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ，然后在无菌场所采集供者的脂肪；（２）获取和分离人脂肪成体干细胞：取２０ｍＬ脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，用ｐＨ值为７．２－７．４的Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为１－２ｍｍ↑［３］小块，加入与所取脂肪组织等体积的０．２％胶原酶磷酸缓冲液消化，在３７℃温度条件下均匀震荡消化５０－７０分钟，再置于离心机中以１６００－２０００转／分钟的转速离心４－１０分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用ｐＨ值为７．２－７．４的Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经１００目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以９００转／分钟离心５分钟，弃去上清液，获得干细胞；（３）培养人脂肪成体干细胞：将获得的干细胞按１－２×１０↑［４］／ｃｍ↑［２］接种于培养瓶，加入１０ｍＬ含１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ的培养液，置于３７℃、ＣＯ↓［２］含量为５％的培养箱中培养，４－５天后更换新的含１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每３－４天更换含１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ的培养液一次，待细胞生长达到８０％融合，在培养瓶中加０．２５％胰酶－ＥＤＴＡ进行消化；将培养瓶放入３７℃孵箱中５分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ的培养液１０ｍＬ，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入５０ｍＬ离心管中，在９００转／分钟的转速条件下离心５分钟，离心结束后，吸弃上清，向离心管中加入３０ｍＬ含１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ的培养液吹打干净混匀细胞，获得培养后的人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于３７℃、ＣＯ↓［２］含量为５％的培养箱中培养，即按１∶３传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；（４）检测、冻存人脂肪成体干细胞：人脂肪成体干细胞的检测步骤为：用１０ｍＬ的Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入１ｍＬ胰酶－ＥＤＴＡ，放入３７℃孵箱中５分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液１０ｍＬ，反复吹打；用微量加...

【技术特征摘要】
1. 一种人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，包括(1)采集脂肪对供者进行ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测、微生物免疫检测，体检 HIV、HBV、HCV，然后在无菌场所采集供者的脂肪；(2)获取和分离人脂肪成体干细胞取20mL脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和 纤维部分，用PH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪 组织绞碎为l_2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的0. 2%胶原酶磷酸缓冲液消化，在 37°C温度条件下均勻震荡消化50-70分钟，再置于离心机中以1600-2000转/分钟的转速 离心4-10分钟，去除表层脂肪；将底层细胞用pH值为7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡盐液反复 吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以900转/分 钟离心5分钟，弃去上清液，获得干细胞；(3)培养人脂肪成体干细胞将获得的干细胞按1-2X IOVcm2接种于培养瓶，加入IOmL 含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，置于37°C、CO2含量为5%的培养箱中培养，4_5天 后更换新的含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天更换含 15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0. 25% 胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37°C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌 轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含15%胎牛血清的高 糖DMEM的培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移 入50mL离心管中，在900转/分钟的转速条件下离心5分钟，离心结束后，吸弃上清，向离 心管中加入30mL含15%胎牛血清的高糖DMEM的培养液吹打干净混勻细胞，获得培养后的 人脂肪成体干细胞，分于三个培养瓶中培养，置于37°C、CO2含量为5%的培养箱中培养，即 按1 3传代，获得传代培养后的人脂肪成体干细胞；(4)检测、冻存人脂肪成体干细胞人脂肪成体干细胞的检测步骤为用IOmL的 D-Hank’ s平衡盐液洗涤传代培养后的人脂肪成体干细胞两次，吸弃洗液，每瓶中加入ImL 胰酶-EDTA，放入37°C孵箱中5分钟，在倒置显微镜下观察细胞，并用手掌轻轻拍打培养瓶 确保细胞及组织块完全消化下来；再在每个培养瓶中加入完全培养液10mL，反复吹打；用 微量加样枪吸出少许置于离心管中用做细胞计数，根据计数结果，吸取含有大约6X IO6个 细胞的细胞悬液分于另一离心管中用于检测，其余用于冻存，将两管细胞以900转/分钟 离心5分钟，吸弃上清，用于检测的细胞用培养液反复吹打细胞、混勻，送入药品非临床研 究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表 型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否达到合 格标准；冻存步骤为向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，使符合1-2X IO6细胞 /0. 9mL胎牛血清，充分混勻，待用；在冷冻管和冷冻盒上粘贴好条码，同时在冷冻管上写上 同一条码号；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1 1比例加入到冻存管内混合， 先将细胞悬液分别加入到冷冻管内后，再统一加入冻存液，封盖，震荡，充分混勻，迅速移入 到-80°C冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，细胞冻存时 有详细的冻存记录，符合冷冻保存标准，储存环境定期监测，人脂肪成体干细胞的检测和冻存是并行进行的，不等检测结果出来，细胞就要被冻存了，待检测结果出来之后，将检测不 合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，放入垃圾袋，集 中放置于指定位置，由专门人员运走处理。2.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中用 镊子剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分。3.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中用 无菌粉碎装置将脂肪组织绞碎。4.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中胶 原酶磷酸缓冲液消化，在37°C温度条件下消化时间为60分钟。5.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中离 心的最佳转速为1800转/分钟，离心5分钟。6.如权利要求1所述的人脂肪成体干细胞的获取方法，其特征在于，所述液氮冷冻温 度为-196°C。7.一种人...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘拥军，刘广洋，徐萌，
申请(专利权)人：和泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]