EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法技术

本发明专利技术公开了一种ＥＧＣＧ单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法。采用高速逆流色谱法从脂溶性的茶多酚或脂溶性ＥＧＣＧ中分离制备出高纯度ＥＧＣＧ单脂肪酸酯的方法。它包括配制构成固定相、流动相的溶剂系统，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份。所构成的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组成，以下相为固定相，上相为流动相。本方法适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备ＥＧＣＧ单脂肪酸酯，分离纯度可达９５％以上。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法。
技术介绍
茶多酚是一种高效低毒的自由基清除剂，在防辐射损伤、抑菌、抗病毒、抗感染、抑制肿瘤、防治心脑血管疾病、抗衰老等方面具有较好的功效，因此，茶多酚作为天然的自由基清除剂及抗氧化剂在天然药物研究与开发上有着很好的应用前景。但由于茶多酚易溶于水，妨碍了它在脂溶性体系中充分发挥效用，因此需对茶多酚中的儿茶素分子进行结构修饰，使其水溶性改性成脂溶性，这样分子更易穿过脂质层，深入脂质体的憎水区，对脂溶性自由基的清除能力增强。例如，国内许多学者曾对茶多酚改性为脂溶性的方法进行了研究，如《精细化工》，19(2)，2002，通过茶多酚与脂肪酰氯反应，制备了一系列含不同直链脂肪基团的脂溶性茶多酚。表明当脂肪链的碳原子数≥10时，脂溶性茶多酚在色拉油中的溶解度是茶多酚的2000倍以上。专利CN1197786A和CN1263083A报道的将水溶性茶多酚改性成脂溶性茶多酚，但由于反应过程中的强酸性环境，无法控制诸如“红粉”的缩合物生成，因而影响产品的抗氧化效果。专利CN1231277A已考虑到避免改性反应中的强酸性环境，其产品的抗氧化能力较好。由于茶多酚中大部分为儿茶素，并且其中以表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)的含量为最高，茶多酚改性成脂溶性茶多酚后，其组成中也应以EGCG的衍生物含量最高，且大部分是同分异构体，性质十分相近，通常的纯化方法较难分离。因此，至今仅从理论上推测了茶多酚改性后其主体成分EGCG衍生物的可能结构，没有对其分离纯化和结构测定工作进行过研究。由于高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了因固态支持体或载体带来的各种问题，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，而且节约溶剂，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学或生物活性物质的制备分离和纯化。通过高速逆流色谱法从脂溶性的茶多酚或脂溶性EGCG中分离制备出高纯度的分子结构确定的EGCG单脂肪酸酯，也必将促进儿茶素类天然药物研究领域的开发和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法。它的步骤为1)配制构成固定相、流动相的两相溶剂系统；2)使逆流色谱仪柱子中充满固定相；3)使逆流色谱的主机转动；4)将流动相泵入逆流色谱仪柱内；5)由进样阀进入脂溶性茶多酚或脂溶性EGCG样品，根据检测器谱图获得EGCG单脂肪酸酯；所说的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组成，下相为固定相，上相为流动相。脂溶性茶多酚或脂溶性EGCG是由EGCG含量高于50％的茶多酚或由EGCG纯度高于95％的EGCG单体为原料，通过与含12-22个碳脂肪酸的酯化反应制得的混合物。EGCG单脂肪酸酯包括表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-5-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-7-O-脂肪酸酯等化合物中的任一种。本分离制备过程能连续进行，操作简便，效率高，EGCG单脂肪酸酯的纯度大于95％。与柱层析等色谱方法比较，它不用任何固态的支撑物或载体，因此不存在固态载体所造成的样品吸附损耗、沾污和变性等问题，是一种经济的从脂溶性的茶多酚或脂溶性EGCG中分离制备高纯度EGCG单脂肪酸酯的方法。本方法适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备EGCG单脂肪酸酯。附图说明图1是脂溶性EGCG的高速逆流色谱分离谱图；图2是脂溶性茶多酚的高速逆流色谱分离谱图。具体实施例方式本专利技术采用高速逆流色谱分离制备方法，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂系统，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成份。所构成的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组成，以下相为固定相，上相为流动相。所述的烷烃为正己烷，所述的脂肪酯为乙酸乙酯，所述的脂肪醇为甲醇或乙醇。在正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水溶剂系统中，它们的体积比范围为1-5∶1-10∶1-10∶1-10，在正己烷一乙酸乙酯一乙醇一水溶剂系统中，它们的体积比范围为1-5∶1-20∶1-10∶1-10。其中，正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水系统的体积比可以为1∶1∶1∶1，1∶1∶1.5∶1或1∶1∶2∶1，正己烷一乙酸乙酯一乙醇一水的体积比为1∶1∶2∶1或1∶0.5∶1∶1.5。所述的溶剂系统，可以逐渐减小上相中甲醇或乙醇/水的体积比，即采用梯度洗脱方式；或改变系统中溶剂配比，降低上相中甲醇或乙醇/水体积比，即采用分步分离方式。所述的溶剂系统，可以将洗脱出的组分作为新的样品，经浓缩后进行二次分离，其溶剂系统不变，但上相中正己烷/乙酸乙酯的体积比增加。另外需要说明的是上述实施例中的含直链脂肪基团的脂溶性茶多酚或脂溶性EGCG，其脂肪链的碳原子数可以是12-22中的任一种。而溶剂系统、分离制备方式、洗脱方式等还可以有多种组合的匹配。权利要求1.一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于它的步骤为1)配制构成固定相、流动相的两相溶剂系统；2)使逆流色谱仪柱子中充满固定相；3)使逆流色谱的主机转动；4)将流动相泵入逆流色谱仪柱内；5)由进样阀进入脂溶性茶多酚或脂溶性EGCG样品，根据检测器谱图获得EGCG单脂肪酸酯；所说的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组成，下相为固定相，上相为流动相。2.根据权利要求1所述的一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于所说的脂溶性茶多酚或脂溶性EGCG是由EGCG含量高于50％的茶多酚或由EGCG纯度高于95％的EGCG单体为原料，通过与含12-22个碳脂肪酸的酯化反应制得的混合物。3.根据权利要求1所述的一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于所说的EGCG单脂肪酸酯包括表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-5-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-7-O-脂肪酸酯等化合物中的任一种。4.根据权利要求1所述的一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于所说的烷烃为己烷(正己烷或异己烷)、戊烷(正戊烷或异戊烷)、庚烷(正庚烷或异庚烷)、辛烷(正辛烷或异辛烷)或它们的混合物(石油醚)，所述的脂肪酯为乙酸乙酯；它们的体积比范围为1-5∶1-10∶1-10∶1-10，在正己烷一乙酸乙酯一乙醇一水溶剂系统中，它们的体积比范围为1-5∶1-20∶1-10∶1-10。5.根据权利要求1或4所述的一种EGCG单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于所说正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水的体积比为1∶1∶1-1.5∶1，正己烷一乙酸乙酯一乙醇一水的体积比为1∶1∶2∶1。6.根据权利要求5所述的一种EGCG单脂肪酸酯的分离制备方法，其特征在于所说溶剂系统正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水的体积比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＥＧＣＧ单脂肪酸酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于：它的步骤为：１）配制构成固定相、流动相的两相溶剂系统；２）使逆流色谱仪柱子中充满固定相；３）使逆流色谱的主机转动；４）将流动相泵入逆流色谱仪柱内；５）由进样阀进入脂溶性茶多酚或脂溶性ＥＧＣＧ样品，根据检测器谱图获得ＥＧＣＧ单脂肪酸酯；所说的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组成，下相为固定相，上相为流动相。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，杜琪珍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]