本发明专利技术公开了一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒。本发明专利技术试剂盒含有ＲＮＡ提取试剂，等温扩增反应管，１０００倍荧光染料。每支等温扩增反应管中包含以下组分：ＫＣｌ、Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｔｒｉｔｏｎ？Ｘ－１００、引物Ｆ３与Ｂ３各２０ｐｍｏｌ、引物ＦＩＰ与ＢＩＰ各５０ｐｍｏｌ、引物ＦＬＰ与ＢＬＰ各４０ｐｍｏｌ、Ｂｅｔａｉｎｅ？１．１ｍＭ、ＡＭＶ反转录酶５Ｕ、Ｂｓｔ？ＤＮＡ聚合酶８Ｕ、ｄＮＴＰ？０．８ｍＭ、ＲＮＡ酶抑制剂４０Ｕ。本发明专利技术检测乙型脑炎病毒的试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简便，检测时间短，结果易于判断，不需ＰＣＲ仪等贵重仪器，适合于实验室以及基层单位应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测乙型脑炎病毒的试剂盒，尤其涉及检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增的专用引物以及含有该引物的环介导等温扩增试剂盒，本专利技术还涉及该试剂盒 在快速检测乙型脑炎病毒中的应用，属于乙型脑炎病毒的检测或诊断领域，
技术介绍
流行性乙型脑炎乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(J即aneseEnc印halitis virus, JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织 中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940 年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。在世界范围内 每年有30， 000-50， 000例乙脑病例，约25 % -30 %死亡，50 %导致永久性中枢神经系统后遗 症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多 种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感 染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜剌激征为特征。母猪感染可引起 流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能 呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马 属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是 该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现 在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。 乙型脑炎病毒属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约llkb。病 毒粒子呈球形，直径约30nm，有囊膜。JEV只有一个血清型，但不同地区及不同时期分离的 毒株按基因序列比较分析可以分为4个基因型。乙型脑炎病毒的各个毒株虽然常在毒力和 血凝特性等方面有比较明显的差异，但抗原性差异不大，没有不同的血清型。乙型脑炎病 毒在抗原上与墨罗山谷脑炎病毒(Murray Vally Enc印halitis Virus,MVEV)，西尼罗病毒 (WestNile Virus, WNV)，圣路易脑炎病毒(S t. Louis Enc印halitisVirus)有血清学交叉 反应，在黄病毒科中属同一血清群。此外，JEV还与登革病毒(Dengue Virus,DV)存在血清 交叉反应。这些病毒都是蚊媒性人兽共患传染病，各种病毒也慢慢突破了早期的流行地域 范围，不断在世界范围内扩散对人类健康及公共卫生造成威胁。及时准确地检测与诊断对 预防控制该类病毒病意义重大。 灵敏、快速、特异的病原检测方法对乙型脑炎的预防控制有重要意义。目前对乙型 脑炎的实验室诊断包括病毒分离和抗体检测以及用分子生物学方法检测病毒基因核酸。动 物拌种或培养细胞接种分离病原方法复杂且耗时长，同时常因样品中病原含量低而分离失 败而造成假阴性结果。IgM检测也能作出JEV感染的诊断，该方法需配合病毒中和实验进 行确证，因为乙型脑炎病毒与其它黄病毒存在血清学交叉反应也影响抗体检测方法的特异 性。RT-PCR和Real-time RT-PCR扩增乙型脑炎病毒基因组核酸是快速检测乙型脑炎病毒 的分子技术。这两种方法要求实验室有PCR仪或Real-time PCR仪，对操作人员素质要求高。且PCR扩增后需通过电泳步骤获得结果也是一个烦杂的问题。 环介导等温基因扩增技术(loop mediated isothermalamplification， LAMP)是 一种新型的核酸扩增技术。扩增反应在恒温条件下进行，是一种特异、高效、快速的扩增DNA 的技术。由于LAMP的扩增效率非常高，扩增反应结果可以通过荧光染料染色在紫外灯下肉 眼观察；扩增反应可产生大量的焦磷酸镁而使反应液呈现混浊，在LAMP扩增结束后无须电 泳就可直接肉眼观察反应是否有混浊现象来判断是否有扩增，且不需要昂贵的PCR仪，可 广泛应用于病毒的临床和基层检测。 采用环介导等温基因扩增技术检测乙型脑炎病毒的前提是需要获得或设计乙型 脑炎病毒特异性引物组，该引物组应具有良好的特异性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术首先根据乙型脑炎病毒不同基因型基因组序列对比结果，设计选择了保守 性高的引物组，再根据乙型脑炎病毒与同一血清群其它黄病毒基因序列进行比较，选择乙 型脑炎病毒特异性引物组。同时对引物进行Blast比较分析，所优化的引物具有很好的特 异性，对猪乙型脑炎病毒感染症状相似的猪细小病毒，猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，猪温病 毒等不能扩增(图1)。 具体的，本专利技术所述的乙型脑炎病毒特异性引物组包括以下引物序列由SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8组成的引物对1 ;由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :6组成的引物对2 ; 由SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所组成的引物对3 ; 本专利技术的乙型脑炎病毒特异性引物组由以上3对引物序列(引物对1、引物对2 和引物对3)所组成；其中引物FI P(SEQ IDN0:3)是由Flc(SEQ ID N0:1)与F2 (SEQ ID NO :2)按以下方式组成FIP = Flc+TTTT+F2。引物BIP(SEQ ID NO :6)是由引物Blc(SEQ ID NO :4)与引物B2(SEQ ID NO :5)按以下方式组成BIP = B1C+TTTT+B2。 <table>table see original document page 4</column></row><table><table>table see original document page 5</column></row><table> 本专利技术在设计筛选扩增引物时，分析比较了 JEV不同基因型毒株的基因序列，所设计筛选的引物对JEV基因I、1 I、I I I型JEV基因都具有较好的同源性，可对不同基因型JEV进行检测。 在获得了乙型脑炎病毒特异性引物组的基础上，本专利技术按照优选的引物组，优化组合等温扩增反应液，通过对引物组合以及引物浓度优化，酶浓度优化，镁离子浓度优化，dNTP浓度优化等反应成分的配比优化，进一步得到了一种乙型脑炎病毒环介导等温扩增(LAMP)检测试剂盒，包括以下成分 (l)RNA提取试剂； (2)等温扩增反应管；每支等温扩增反应管包含以下成分10mM KCl、20mMTris-Cl、10mM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. 1 % TritonX-100、引物SEQ ID N0:7(F 3)与SEQIDNO :8(B3)各20pmol、引物SEQ ID NO :3 (FIP)与SEQ ID NO :6 (BIP)各50pmol、引物SEQ IDN0:9(FLP)与SEQ ID N0:10(BLP)各40pmol、Betaine1. lmM、AMV反转录酶5U、Bs t DNA聚合酶8U、 dNTP 0. 8mM、 RNA酶抑制剂40U ; (3) 1000倍荧光染料SYBR Green I。 其中，所述的R本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于环介导等温基因扩增方法检测乙型脑炎病毒的特异性引物组，其特征在于，包括以下引物序列：由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８组成的引物对１；由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６组成的引物对２；由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０所组成的引物对３。 说明：删去的权利要求２的技术方案已在序列３和６中已清楚的体现；再进行限定属重复的技术方案，故删去。
【技术特征摘要】
用于环介导等温基因扩增方法检测乙型脑炎病毒的特异性引物组，其特征在于，包括以下引物序列由SEQ ID NO7和SEQ ID NO8组成的引物对1；由SEQ ID NO3和SEQ ID NO6组成的引物对2；由SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所组成的引物对3。说明删去的权利要求2的技术方案已在序列3和6中已清楚的体现；再进行限定属重复的技术方案，故删去。2. 权利要求1所述的特异性引物组在制备诊断或检测乙型脑炎病毒试剂中的用途。3. —种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的特异性引物组。4. 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包括以下成分(1) RNA提取试剂；(2) 等温扩增反应管；其中每支等温扩增反应管包含以下成分10mMKCl、20mM T...
【专利技术属性】
技术研发人员：华荣虹，步志高，宋永，杜鹃，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。