发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用技术

本发明专利技术公开了一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。本发明专利技术首次将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法应用于大豆，成功地进行了大豆根部毛状根转化。本发明专利技术对种子萌发时间、筛选剂浓度进行优化，不仅能够增加每个大豆外植体诱导出的转基因毛状根数量，而且能够显著提高毛状根的转化频率和生长状态，在无菌条件下成功地利用大豆转化常用的筛选标记除草剂获得大豆“复合植株”，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，是在无菌组织培养条件下研究与根系形态、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的理想材料。

Application of Agrobacterium tumefaciens mediated hypocotyl coating transformation method in soybean transformation

The invention discloses a hypocotyl coating and transformation method mediated by Agrobacterium rhizogenes and its application in soybean transformation. The invention applies the hypocotyl mediated transformation method of Agrobacterium rhizogenes to soybean for the first time, and successfully succeeds in transforming hairy roots of soybean roots. The invention of seed germination time, concentration of selection agent is optimized, not only can increase the quantity of each soybean explants derived from transgenic hairy roots, and can significantly improve the conversion frequency and growth of hairy roots, the successful use of herbicide selection marker soybean transformation commonly used under aseptic conditions of soybean, the \composite plant\ both transgenic and non transgenic roots, the upper part, is the cultivation of the ideal material research and root morphology, root condition of symbiotic nitrogen fixation and mycorrhiza formation related genes in sterile tissue.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。
技术介绍
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现，与植物基因转化有关的农杆 菌有两禾中 一是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，它含有Ri (root inducing plasmid)质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛状根(hairy root) ;二是根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)，它含有Ti (tumor inducing plasmid)质茅立，會g诱导被侵染 的植物细胞形成冠瘿瘤。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌Ri质粒诱导形成的毛状根，生长 速度快，生长条件可以人为控制且遗传上稳定，因而是进行许多与根系相关的理论研究的 理想实验系统。毛状根还可以作为研究作物根部寄生的病虫害病理的良好材料，毛状根系 统在离子吸收、次生代谢物合成过程及运输等方面的研究中也是非常有用的实验系统。因 此，自从Ri质粒被人们发现并认识以来，它已广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产 物生产、植物品种改良和植物栽培等领域，显示出了极其广阔的应用前景(杜旻等，2005)。 此外，由发根农杆菌感染植物获得的毛状根再生的后代会出现矮化现象，因此在花卉矮化 育种中也具有特别的意义。 发根农杆菌的转化方法很多，大体包括植物体直接接种法和外植体共感染接种法两种。植物体直接接种法即用活化好的新鲜菌液或菌斑对植物的无菌幼苗反复注射或涂抹 (2 3次)，两周后即可在注射或涂抹部位产生毛状根(张艳馥等，1997 ;王关林和方宏筠， 2002)。针剌注射是常用的转化方法，Van de Velde等(2003)用新鲜菌液直接注射接种生 长着的田菁无菌幼苗下胚轴，诱导出毛状根。Rodriguez-Llorente等(2003)用菌液直接针 剌接种截型苜蓿下胚轴也获得了毛状根，Kereszt(2007)则用菌液直接针剌接种生长在基 质中的大豆幼苗的下胚轴，得到了大豆的复合植株(Composite plant)。涂抹法常用于 毛状根无菌条件下的诱导。Boisson-Dernier等(2001)将萌发30小时的截型苜蓿种子切 除3毫米长的胚根，切口用发根农杆菌菌斑涂抹侵染也得到既有转基因毛状根，又有非转 基因的地上部的复合植株;Uhde-Stone等(2005)利用相似的方法得到了豌豆的复合植 株。植物体直接接种法得到的复合植株的优点在于既有转基因的根，又有非转基因的 地上部，是研究与根部共生固氮和VA菌根形成有关的基因的理想材料。其中，涂抹法可以 在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用于微生物共生及根系生理生化方面的研 究(Boisson-Dernier et a1，2001 ;Uhde-Stone et a1，2005)。 大豆(Glycine max)是我国重要的粮食和油料作物。在几种主要粮食作物中，大 豆蛋白质含量最高，所以大豆是人类理想的植物蛋白来源(王文真等，1998)。与此同时，大 豆也是基因工程中公认的，难以进行根癌农杆菌介导的整株转化的作物之一。因此，发根 农杆菌转化方法由于简便，快速越来越广泛地用于大豆的分子遗传研究，如基因的表达分析、启动子功能分析、大豆与根瘤菌或菌根的共生研究以及大豆病虫害的离体研究等方面 (Somers et al，2003)。 发根农杆菌的涂抹法转化可以在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用 于大豆根部共生固氮、菌根共生及根系生理生化方面的研究，但涂抹直接接种法转化在大 豆上至今还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是克服现有技术的不足，提供下胚轴涂抹转化方法在大豆转化 方面的应用。 本专利技术的另 一个目的是提供大豆根部转化方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现 提供发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。所述应用是选用大豆种子进行萌发，切除胚根，切口用含有pCAMBIA3301-GUS表达载体的，由A4演化来的MSU440发根农杆菌为涂抹菌斑进行下胚轴涂抹侵染，进行遗传转化，获得含有GUS报告基因的大豆转基因毛状根。所述大豆基因型选用粤春03-3(YC03-3)或本地2号(BD2)。 本专利技术提供了一种大豆根部转化方法，包括以下步骤 (1)种子消毒和种子萌发； (2)发根农杆菌MSU440菌斑制备； (3)外植体制备及转化。 本专利技术不仅建立了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，而且在遗传转化 过程中，对种子萌发时间、受体大豆基因型和筛选剂浓度也进行了优化，优化条件如下 上述步骤(1)所述种子萌发包括以下步骤 将消毒的种子播种于萌发培养基上，28t:暗培养约20小时，待胚根长出有lcm时， 准备进行发根农杆菌侵染。 上述步骤(2)是将含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440，在 YEP培养基上划板，28。C培养两天得到含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌MSU440 菌斑。所述含质粒载体pCAMBIA3301-GUS的发根农杆菌菌株MSU440是通过常规的农杆 菌冻融法转化将pCAMBIA3301-GUS质粒转入发根农杆菌MSU440感受态细胞获得。 上述步骤(3)所述外植体制备及转化程序包括以下步骤 (1)将萌发的大豆种子切除约3mm的胚根，切口用农杆菌菌斑涂抹侵染，然后 将大豆放在含有毛状根诱导培养基的方形培养皿中，所述毛状根诱导培养基采用改良的 1/2XHoagland营养液配制，加入0. 6%琼脂粉。所述毛状根诱导培养基加有浓度为5. Omg/ L的筛选剂。 所述筛选剂的配制方法是将0. 025克除草剂(Glufosinate)溶于25mL双蒸水后 过滤灭菌配制lmg/ml的浓縮液。用时1L培养基中加入2. 5或5毫升lmg/ml的浓縮液产 生2. 5mg/L或5mg/L筛选剂浓度。 (2)培养皿45t:放置3天，然后将培养皿竖直放置在培养箱中，培养条件为温度18 20°C、14小时光照、光强200E/m7sec ;筛选10天后，将培养基中切去胚根的大豆苗放 入含有2. 5mg/L筛选剂的毛状根诱导培养基中继代培养，筛选转基因毛状根，20 30天后， 毛状根产生，用于GUS染色分析。 所述转基因毛状根的筛选方法是采用筛选前期(侵染后10天)使用较高的筛选剂浓度，5. 0mg/L ;后期(10天后)将筛选剂浓度降低至2. 5mg/L筛选剂。 本专利技术建立和优化了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，可以在无菌组织培养条件下进行发根农杆菌侵染以用于大豆根部共生固氮、菌根共生及根系生理生化方面研究。 本专利技术的有益效果如下 (1)本专利技术首次在大豆中建立了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法。将 发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法成功应用于大豆，在无菌条件下利用大豆转化常用 的筛选标记除草剂获得大豆复合植株，其既有转基因的根部，又有非转基因的地上部，提 供了在无菌组织培养条件下研究与根系生理生化、根部共生固氮和菌根形成有关的基因的 理想材料。(2)本专利技术优化了大豆发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法，精确确定了种子萌发时间、不同筛选时期使用不本文档来自技高网...

【技术保护点】
发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。

【技术特征摘要】
发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法在大豆转化方面的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于是选用大豆种子进行萌发，切除胚根，切口 用含有pCAMBIA3301-GUS表达载体的、由A4演化来的MSU440发根农杆菌为涂抹菌斑进行 下胚轴涂抹侵染，进行遗传转化，获得含有GUS报告基因的大豆转基因毛状根。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述大豆种子的基因型为粤春03-3或本地 2号。4. 一种大豆根部转化方法，其特征在于包括以下步骤(1) 大豆种子的萌发；(2) 制备发根农杆菌MSU440菌斑；(3) 采用发根农杆菌介导的下胚轴涂抹法进行外植体制备及转化。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述种子萌发包括以下步骤将 消毒的大豆种子播种于萌发培养基上，28t:暗培养20小时，萌发至胚根长出lcm。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(3)所述外植体制备方法是将萌发的 大豆种子切除3mm的胚根，切口用含有pCAMBIA3301-GUS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀荣，廖红，严小龙，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]