使胚胎干细胞分化成表达ＡＱＰ－１的细胞的方法技术

本发明专利技术涉及使人胚胎干（ＥＳ）细胞分化成表达ＡＱＰ－１的细胞（具体为肾上皮细胞）的方法。该公开的方法包括：在细胞外基质分子存在下，在肾特异性培养基中培养人ＥＳ细胞。根据所述方法制得的细胞可以用于治疗如肾衰竭、肾变病、布赖特氏病和肾小球炎的肾有关的疾病。

Method for differentiating embryonic stem cells into cells expressing AQP1

The present invention relates to human embryonic stem (ES) cells to differentiate into cells expressing AQP1 (specific for renal epithelial cell) method. The disclosed method includes culturing human ES cells in a kidney specific medium in the presence of an extracellular matrix molecule. According to the method of the prepared cell can be used to treat such as renal failure, nephrotic syndrome, renal glomerular inflammation and bright's disease related diseases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使胚胎干细胞分化成表达AQP-I的细胞的方法。
技术介绍
旨在代替器官丧失的功能的再生药物中的各种途径受到了缺乏足够细胞来源的 限制。因此，重要的研究已把注意力贯注在探究人胚胎干(hES)细胞作为潜在的细胞来源 上。人胚胎干(hES)细胞能够无限的自我更新并且是多能性的；就是说，这些细胞能够分化 成它们源自的生物体中存在的几乎所有类型的细胞(2，3)。同样地，hES细胞可以提供用于 许多种研究和医学目的的不同细胞类型的供给。一种这样的用途是用于治疗肾病和肾功能不全。II型糖尿病的患病率的增加已导 致末期肾病的发病率增长。增加的患病率加上用于治疗的供选方案有限已使肾脏疾病成为 全世界主要的健康问题(2，4)。肾脏的主要功能包括排除代谢废物和调节水、电解质和酸碱平衡。这些主要是通 过以下实现的(i)发生在肾小球中并导致形成体积为1801/天的初级滤液的过滤过程，和 ( )在后来的管状系统中的重吸收过程(5-7)。过滤时，在代谢废物的重吸收减少或未减 少的情况下，大多数水和溶解物质通过在近端肾小管上皮的转运返回到毛细管系统(5-7)。 名为水通道蛋白-Kaquaporin-l (AQP-I))的特定的转运水的通道蛋白确保大量的水重吸 收，该蛋白位于上皮细胞的细胞膜上，在肾的近端小管结构中排列成单层(8-10)。已设计人工装置模仿肾功能。在这种装置中，装配成中空纤维滤柱的聚合物膜能 够执行通常由肾小球执行的尺寸选择性过滤过程，并且用于血液透析或血液过滤的装置已 被证明成功地用于临床应用中。相反，模拟肾的重吸收功能的方法的发展似乎在很大程度 上取决于肾细胞的特定功能性(11-12)。
技术实现思路
专利技术概述本专利技术提供了一种在体外由人胚胎干(hES)细胞产生能够以与肾上皮细胞相似 方式运输水分的细胞的方法。该方法包括在提供诱导分化成表达水通道蛋白-I(AQP-I)的 细胞的肾源性分化条件的细胞外基质分子的存在下并且在肾特异性生长培养基中培养hES 细胞。因此，本专利技术方法具有为包括通过用来代替上皮组织的生物人工装置、细胞疗法 和组织工程学对失去的肾功能进行治疗的疗法提供大量需要的细胞来源的潜力。一方面，提供了一种使人胚胎干(hES)细胞分化成表达AQP-I的细胞的方法，该方法包括在足够诱导hES细胞分化成表达AQP-I的细胞的条件下，在细胞外基质(ECM)分子存在下，在肾特异性培养基中培养未分化的hES细胞。在不同的实施方式中，所述肾特异性培养基可包含肾上皮基础培养基或肾上皮生 长培养基并且可包含表皮生长因子。所述ECM分子可包含纤连蛋白、层粘连蛋白、IV型胶 原和基质胶基质(Matrigel matrix)中的至少一种。在细胞培养之前或期间，还可以将骨 形态生成蛋白2加入到肾特异性培养基中。在一个实施方式中，该方法包括在培养之前或期间，将骨形态生成蛋白2以约 2. 5 约lOng/ml的浓度加入到肾特异性培养基中，其中，所述培养包括使细胞生长7_10 天，所述肾特异性培养基包含肾上皮生长培养基，而所述ECM分子包含基质胶基质，且其 中，一旦分化，细胞就表达AQP-I以及CK-18、β-连环蛋白、⑶-326和⑶-133中的至少一 种。另一方面，提供了在细胞外基质分子存在下以及在肾特异性培养基中由人胚胎干 细胞群体直接分化的细胞群体，其中，约2% 约50%的细胞表达AQP-I。该细胞群体可以 通过本文中所述的方法制备。还一方面，提供了一种生物人工小管辅助装置，该装置包括具有内腔(内腔用细 胞外基质(ECM)分子涂覆)的中空纤维和本文中所述的细胞群体。又一方面，提供了一种制备生物人工小管辅助装置的方法，该方法包括提供包括 具有内腔的中空纤维并将本文中所述的细胞群体植入内腔的生物人工小管辅助装置，其 中，在植入细胞群体之前，用细胞外基质分子涂覆所述内腔。细胞外基质分子可包含纤连蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原和基质胶基质中的至少 一种。可以将细胞培养成覆盖内腔的铺满的单层。再一方面，提供了一种在需要治疗的被试者中治疗肾有关的疾病的方法，该方法 包括在被试者的需要表达AQP-I的细胞的部位中植入有效量的本文中所述的细胞群体。可 以直接植入细胞或者可以在生物人工小管辅助装中提供细胞。还一方面，提供了一种在被试者中治疗肾有关的疾病的方法，该方法包括将本文 中所述的生物人工小管辅助装置外部连接到需要治疗的被试者上。所述肾有关的疾病可以包括肾衰竭、肾病、糖尿病肾病、肾变病、布赖特氏病、肾机 能不全、肾小球炎、肾小球硬化症或肾炎。结合附图，在回顾本专利技术的具体实施方式的下列描述后，对于本领域普通技术人 员来说，本专利技术的其它方面和特点将变得明显。附图说明在图中，只通过实施例说明本专利技术的实施方式图1 未分化的hES细胞的培养。a,在MEF饲养层上和在具有MEF衍生的条件培养 基的MATRIGEL (MG)上培养的hES细胞。b，显示0ct3/4表达的hES细胞的免疫染色(红 色)。DAPI用于使核染色(蓝色)。c，通过对两种培养条件中的干细胞特异性标记(如 0ct3/4、Sox2、CD9和Nanog)进行RT-PCR的基因表达分析。图2 :hES细胞向表达AQP-I的上皮细胞的分化。a，用AQP-I (红色)和细胞角蛋 白-18 (绿色)对在纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(Lam)、IV型胶原(Col IV)和MATRIGEL (MG)上培养10天的hES细胞进行免疫染色。DAPI用于使核染色(蓝色)。b，用AQP-I (红色) 与DAPI (蓝色)一起对在相同培养条件下传代培养的hES细胞进行免疫染色。a-c，当在 MATRIGEL 上培养细胞时和在全部四种所选的ECM分子上传代培养细胞时可以发现AQP-I 表达提高了。d，双重染色实验显示，表达AQP-I (红色)的分化的hES细胞是用细胞角蛋 白-18 (绿色)染色的上皮细胞。e，分化的hES细胞，特别是表达AQP-I的细胞(绿色)，对 HNuc (红色)是阳性染色的，说明它们是人源的。图3 未分化的hES细胞(泳道6)和分化的hES细胞(泳道1_5)的蛋白质分布图。从在纤连蛋白(泳道1)、层粘连蛋白(泳道2)、IV型胶原(泳道3)、MATRIGEL (泳 道4)上生长的细胞、在纤连蛋白(泳道5)上传代培养的细胞和未分化的hES细胞(泳道 6)中提取总蛋白，并进行SDS-PAGE，接着电转移到PVDF膜上。所述膜用抗体(如AQP-1、 CK-18、β -连环蛋白、0ct3/4和GAPDH)探查。未分化的hES细胞(泳道6)显示AQP-I和 β -连环蛋白没有表达，而细胞角蛋白-18弱表达，同时0ct3/4维持表达。相反，在肾源性 培养条件下，观察到了 AQP-I、CK-18和β -连环蛋白的增量调节。在MATRIGEL (泳道4) 上培养细胞和在纤连蛋白(泳道5)上传代培养细胞时，发现了较高强度的表达图像。这些 结果表明了功能性上皮表型(η = 6)的采用。图4 对hES细胞附着、生长和细胞增殖的单个成分分析。a，在REGM中省略单一因 素的影响。缺乏FBS时，很少细胞附着到MATRIGEL 表面。全部其他条件导致细胞附着和 生长。b，各种因素对细胞增殖的作用。胰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使人胚胎干（ｈＥＳ）细胞分化成表达ＡＱＰ－１的细胞的方法，该方法包括：在足够诱导ｈＥＳ细胞分化成表达ＡＱＰ－１的细胞的条件下，在细胞外基质（ＥＣＭ）分子存在下，在肾特异性培养基中培养未分化的ｈＥＳ细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-7-19 60/929,960一种使人胚胎干(hES)细胞分化成表达AQP-1的细胞的方法，该方法包括在足够诱导hES细胞分化成表达AQP-1的细胞的条件下，在细胞外基质(ECM)分子存在下，在肾特异性培养基中培养未分化的hES细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肾特异性培养基包括肾上皮基础培养基或 肾上皮生长培养 基。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述ECM分子包括纤连蛋白、层粘连蛋白、 IV型胶原和基质胶基质中的至少一种。4.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述肾特异性培养基包含表皮生长 因子。5.根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其进一步包括在所述培养之前或期间将 骨形态生成蛋白2加入到所述肾特异性培养基中。6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述培养之前或期间将骨形态生成蛋 白2以约2. 5 约lOng/ml的浓度加入到所述肾特异性培养基中，其中，所述培养包括使所 述细胞生长7-10天，所述肾特异性培养基包含肾上皮生长培养基，以及所述ECM分子包含 基质胶基质，并且其中，所述细胞一旦分化即表达AQP-I以及CK-18、β-连环蛋白、⑶-326 和⑶-133中的至少一种。7.一种在细胞外基质分子存在下并且在肾特异性培养基中由人胚胎干细胞群体直接 分化的细胞群体，其中，约2% 约...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔M舒马克，雅姬Y邢，安内戈瑞特舒马克，卡尔蒂安纳拉亚南，冈特毛巴，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]