复合菌群ＣＰＸ及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种通过驯化、筛选的方法得到能够快速降解毒死蜱及其代谢产物的复合菌群ＣＰＸ；其利用微生物之间存在互生、共生和协同作用，菌种互相依赖形成特殊的水解途径，达到降解毒死蜱的目的；本发明专利技术中提供的复合菌群ＣＰＸ能够在在１２小时内将５０ｍｇ／Ｌ浓度的毒死蜱降解６４．７％，４８小时内降解８０．３％，４天后能降解９５％以上。在相同的培养条件下，比单菌株的降解能力提高了５倍以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菌株的培养筛选领域，特别是，涉及一种可降解毒死蜱的复合菌群 CPX。
技术介绍
毒死蜱(chlorpyrifos)，有效成分化学名称0，0_ 二乙基_0_ (3，5，6_三氯_2_吡 啶基)硫逐磷酸酯，是美国陶氏化学公司于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷 酸酯类杀虫剂，(Journal of Agricultural and Food Chenmistry，57 :1882—1889，2009) 广泛应用于叶菜类和瓜果类蔬菜的病虫害防治，是目前全球使用最广泛的5种杀虫剂之一 (Biotechnol Lett 29 :1469_1473，2007)。随着毒死蜱在我国产销量的逐年增加和使用范 围的不断扩大，必然会对出口农产品产生不利影响，危害人畜健康，并对水、土壤等环境带 来严重污染。因此，如何有效地处理毒死蜱的毒性和残留带来的污染，成为人们亟待解决的 问题。目前筛选到的能够降解毒死蜱的菌株都是单一的纯化菌株，降解时间一般在4-6天 左右ο而且，单菌株的降解能力有限且降解时间较长。由于培养条件的影响等，随着降解 菌株传代培养，菌株的降解能力退化严重。许多单菌株不能够降解毒死蜱的代谢产物，从而 造成代谢产物的积累，且由于代谢产物会抑制菌株的生长，因此不能够完全降解毒死蜱。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可降解毒死蜱的复合菌群，以克服现有技术的缺陷。本专利技术的目的还在于提供该复合菌群的制备方法。本专利技术的复合菌群CPX通过下述步骤制备获得1)采集农药厂的活性污泥样品；2)将步骤1)的活性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养基于25 350C 150 200rpm富集培养6 10天后，取培养体积的10% 15%转接至新鲜富集培养 基中并将毒死蜱农药浓度提高至50mg/L，再继续培养6 10天后，取培养体积的10% 15%转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至100mg/L，然后转接5 8次，且 每次都将毒死蜱浓度提高100mg/L，直至富集培养基中农药浓度提高到500 800mg/L ；3)富集培养结束后，取培养体积的10% 15%，IOOOOrpm离心收集菌体，然后转 接到无机盐培养基，添加毒死蜱至浓度为500 800mg/L，相同培养条件下再分别驯化两 周；同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性；4)驯化结束后，取培养体积的10% 15%左右的驯化菌液在以毒死蜱为唯一碳 源，浓度为25 800mg/L的无机盐培养基内连续继代培养筛选3 5次，培养得到复合菌 群 CPX。其中，所述步骤2)中，将步骤1)的活性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养 基于35°C 200rpm富集培养7天后，取培养体积的15%转接至新鲜富集培养基中并将农药浓度提高至50mg/L，再继续培养7天，取培养体积的15%转接至新鲜富集培养基中并将毒 死蜱农药浓度提高至100mg/L，再继续培养7天后，连续转接8次，且每次都将毒死蜱浓度提 高100mg/L，直至富集培养基中农药浓度提高到800mg/L。所述步骤3)中，富集培养结束后，取培养体积的15%，IOOOOrpm离心5min收集菌 体，然后转接到无机盐培养基添加毒死蜱至浓度为800mg/L，相同培养条件下再驯化两周， 同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性。所述步骤4)中，取培养体积的15%的驯化菌液在以毒死蜱为唯一碳源，浓度为 500mg/L的无机盐培养基内连续继代培养筛选5次，培养得到复合菌群CPX。所述步骤2)中的富集培养基具有以下组成蛋白胨10g/L，NaCll. 0g/L, KH2PO4 1. 0g/L, pH 7。所述步骤3)和步骤4)中无机盐培养基具有以下组成=K2HPO4O. 2g/L，KH2PO4 0. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 0. 002g/L, (NH4)2SO4 0. 2g/L, CaSO4 0. 08g/L。本专利技术还提供制备上述复合菌群CPX的方法，包括下述步骤1)采集农药厂的活性污泥样品；2)将步骤1)的活性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养基于25 35°C 150 200rpm富集培养6 10天后，取培养体积的10% 15%转接至新鲜富集培养基中 并将毒死蜱农药浓度提高至50mg/L，再继续培养6 10天后，取培养体积的10% 15%转 接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至100mg/L，然后转接5 8次，且每次都 将毒死蜱浓度提高100mg/L，直至富集培养基中农药浓度提高到500 800mg/L ；3)富集培养结束后，取培养体积的10% 15%，IOOOOrpm离心收集菌体，然后转 接到无机盐培养基，添加毒死蜱至浓度为500 800mg/L，相同培养条件下再分别驯化两 周；同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性；4)驯化结束后，取培养体积的10% 15%左右的驯化菌液在以毒死蜱为唯一碳 源，浓度为25 800mg/L的无机盐培养基内连续继代培养筛选3 5次，培养得到复合菌 群 CPX。本专利技术还提供包含上述复合菌群CPX的菌剂。本专利技术还提供所述复合菌群CPX在降解有机磷酸酯类杀虫剂中的应用。本专利技术还提供所述复合菌群CPX在降解毒死蜱中的应用。本专利技术具有以下有益效果1)通过驯化、筛选的方法得到能够快速降解毒死蜱及其代谢产物的复合菌群；2)利用微生物之间存在互生、共生和协同作用，菌种互相依赖形成特殊的水解途 径，达到降解毒死蜱的目的；3)本专利技术中提供的复合菌群CPX能够在在12小时内将50mg/L浓度的毒死蜱降解 64.7%,48小时内降解80. 3%，4天后能降解95%以上。在相同的培养条件下，比单菌株的 降解能力提高了 5倍以上。附图说明图1复合菌群CPX对毒死蜱的降解率；图2复合菌群CPX对毒死蜱的降解曲线；5图3毒死蜱的气相色谱图；图4毒死蜱的高效液相色谱图。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例11)自山东华阳集团农药厂的污水处理池采集活性污泥样品；2)将步骤1)的活性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养基于35°C 200rpm富 集培养7天后，取培养体积的15%转接至新鲜富集培养基中并将农药浓度提高至50mg/L， 再继续培养10天，取培养体积的15%转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高 至100mg/L，连续转接8次，且每次都将毒死蜱浓度提高100mg/L，直至富集培养基中农药浓 度提高到800mg/L。3)富集培养结束后，取培养体积的15%，IOOOOrpm离心5min收集菌体，然后分别 转接到无机盐培养基，添加800mg/L的毒死蜱，相同培养条件下再分别驯化两周；同时更换 不同溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性。4)取培养体积的15%的驯化菌液，在以浓度为500mg/L的毒死蜱为唯一碳源的无 机盐培养基内连续继代培养筛选5次，培养得到复合菌群CPX并测定其对毒死蜱(50mg/L) 的降解率(见图1、图2)。其中，所述步骤2)中的富集培养基具有以下组成蛋白胨10g/L，NaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合菌群ＣＰＸ，其通过下述步骤制备获得：　　１）采集农药厂的活性污泥样品；　　２）将步骤１）的活性污泥样品用含毒死蜱２５ｍｇ／Ｌ的富集培养基于２５～３５℃１５０～２００ｒｐｍ富集培养６～１０天后，取培养体积的１０％～１５％转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至５０ｍｇ／Ｌ，再继续培养６～１０天后，取培养体积的１０％～１５％转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至１００ｍｇ／Ｌ，然后转接５～８次，且每次都将毒死蜱浓度提高１００ｍｇ／Ｌ，直至富集培养基中农药浓度提高到５００～８００ｍｇ／Ｌ；　　３）富集培养结束后，取培养体积的１０％～１５％，１００００ｒｐｍ离心收集菌体，然后转接到无机盐培养基，添加毒死蜱至浓度为５００～８００ｍｇ／Ｌ，相同培养条件下再分别驯化两周；同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性；　　４）驯化结束后，取培养体积的１０％～１５％左右的驯化菌液在以毒死蜱为唯一碳源，浓度为２５～８００ｍｇ／Ｌ的无机盐培养基内连续继代培养筛选３～５次，培养得到复合菌群ＣＰＸ。

【技术特征摘要】
一种复合菌群CPX，其通过下述步骤制备获得1)采集农药厂的活性污泥样品；2)将步骤1)的活性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养基于25～35℃150～200rpm富集培养6～10天后，取培养体积的10％～15％转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至50mg/L，再继续培养6～10天后，取培养体积的10％～15％转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至100mg/L，然后转接5～8次，且每次都将毒死蜱浓度提高100mg/L，直至富集培养基中农药浓度提高到500～800mg/L；3)富集培养结束后，取培养体积的10％～15％，10000rpm离心收集菌体，然后转接到无机盐培养基，添加毒死蜱至浓度为500～800mg/L，相同培养条件下再分别驯化两周；同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液，以排除菌株对溶剂的依赖性；4)驯化结束后，取培养体积的10％～15％左右的驯化菌液在以毒死蜱为唯一碳源，浓度为25～800mg/L的无机盐培养基内连续继代培养筛选3～5次，培养得到复合菌群CPX。2.根据权利要求1所述的复合菌群CPX，其特征在于，所述步骤2)中，将步骤1)的活 性污泥样品用含毒死蜱25mg/L的富集培养基于35°C 200rpm富集培养7天后，取培养体积 的15%转接至新鲜富集培养基中并将农药浓度提高至50mg/L，再继续培养7天，取培养体 积的15%转接至新鲜富集培养基中并将毒死蜱农药浓度提高至100mg/L，再继续培养7天 后，连续转接8次，且每次都将毒死蜱浓度提高100mg/L，直至富集培养基中农药浓度提高 到 800mg/L。3.根据权利要求1所述的复合菌群CPX，其特征在于，所述步骤3)中，富集培养结束 后，取培养体积的15%，IOOOOrpm离心5min收集菌体，然后转接到无机盐培养基添加毒死 蜱至浓度为800mg/L，相同培养条件下再驯化两周，同时更换不同溶剂溶解的毒死蜱母液， 以排除菌株对溶剂的依赖性。4.根据权利要求1所述的复合菌群CPX，其特征在于，所述步骤4)中，取培养体积的...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫艳春，史延华，曲杰，翟逸，李康，王圣惠，
申请(专利权)人：中国农业科学院研究生院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]