本发明专利技术涉及一种具有两条活性Ｘ染色体的人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物，该人孤雌胚胎干细胞系的核型在１０代以前是４６，ＸＸ；从第２０代开始，该细胞系的核型变成了嵌合体；到了第３５代，该细胞系的所有细胞都发生了一条活性Ｘ染色体的丢失；在Ｘ染色体失活的检测中，一直维持只有活性Ｘ染色体的状态，而没有发现有失活的Ｘ染色体的存在。本发明专利技术采用引起第二极体排出的人工激活条件来实现孤雌激活，由此得到所述人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物。本发明专利技术对于探讨该细胞在遗传学和表观遗传学的特性，进而应用于临床上治疗某些疾病具有重要意义，还可通过对该细胞的基因改造或表观遗传学修饰，作为细胞替代治疗的细胞来源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多能性胚胎干细胞，尤其是涉及一种人孤雌胚胎干细胞系及其 衍生物。
技术介绍
众所周知，所谓孤雌生殖是在无需精子的条件下，自发或经物理、化学刺 激，使卵细胞发育成为一个胚胎的过程。即无雄性配子的任何作用，由雌性配 子产生的胚胎。不论其是否发育成个体，均称为孤雌生殖。自然界孤雌生殖是 一种繁殖现象，在爬行类动物、鱼类动物、鸟类动物也存在着一定的孤雌生殖 现象。哺乳动物虽然不能通过这种方式进行繁殖，但是可以通过体外人工刺激模 拟受精过程，使卵母细胞在无需精子条件下被激活，从而获得孤雌胚胎。这是 一项重要的生物技术，可用于间接评估卵母细胞的质量、分析早期胚胎发育中 父系母系配子相互作用、研究胚胎发育初始机制。同时成熟卵母细胞的体外激活方法还是通过核移植进行动物克隆的必要条件(Gasparrini et al.， 2004; Sengoku et al.， 2004; Zhu et al., 2003)。孤雌激活的卵母细胞对研究人类卵母 细胞的激活进程及原核胚胎的形成提供可替代资源(Sengoku et al., 2004)。孤雌生殖技术也是建立胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ESC)系的一 项重要技术(Mizutani et al.， 2004)。 ESC是从早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)分离出来的多能 性干细胞，后者又称为胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)。这些 细胞能够在体外长期增殖而保持不分化状态，具有正常二倍体核型，表达各种 多能干细胞特异性标记，且能在体内外分化为代表三个胚层的各种细胞和组织 类型(包括生殖腺和生殖细胞)。虽然随着医学技术的发展，越来越多的疾病被 攻克，但是由于自身细胞不可逆的坏死或功能缺陷所导致的疾病，至今仍未有有效的治疗方法，其中代表性的疾病有糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默综合症、 脊髓损伤、白血病、心肌梗塞等。治疗这类疾病最有效的方法就是进行细胞或 器官移植，遗憾的是，受这些疾病折磨的病人数量远远超过了可供移植的器官 数量。人类胚胎干细胞的出现使这些疾病的治疗成为可能，虽然现阶段的研究 尚未能达到临床应用的水平，但是利用胚胎干细胞进行体外培养、增殖、分化 的研究已经取得了很大的进展，从而为进一步的细胞、组织或器官移植奠定了 基础，将来可用于无数疾病的治疗，它的应用涉及医学的各个领域，是未来再 生医学最具潜力的种子细胞。ESC临床应用的主要障碍是其衍生物的移植可能会导致同种异体排斥反应(Drukker and Benvenisty, 2004)。这种排斥反应的 危险程度与供受体间的细胞表面抗原呈递蛋白的不一致程度成正相关。最理想 的移植状态是，供体组织的主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex, MHC)与受体完全一致。人类的MHC被命名为人白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen, HLA)系统。供受体的HLA抗原匹配可以减少受体细胞毒T 细胞的反应，从而增加移植物存活的几率。为了解决移植后的免疫排斥问题， 必须使用抗排斥药物或者建立一个很大的ES细胞库来进行配型。前者使用抗 排斥药物对人体有害，而后者是一个巨大的工程，近期内不可能实现。由于体 细胞克隆技术的出现，使人们意识到建立具有与患者相同组织相容性复合物的 胚胎干细胞系的设想成为可能。如此，人们可以得到没有免疫排斥的胚胎干细 胞系，然后诱导分化成所需的细胞进行替代性治疗。但是这种方法存在克隆效 率低、卵子来源有限以及伦理学争议大等缺点。而对于雌性动物或者女性来说，利用其卵母细胞可以通过人工激活的方法 得到囊胚这个特点，人们提出了利用孤雌激活胚胎建立胚胎干细胞的想法。这 个想法首先在小鼠上得至U了实现(Szabo and Mann， 1994; Kaufman et al.， 1983)，人们建立了小鼠的孤雌和孤雄胚胎干细胞系，并分析了其甲基化状态。 之后，科学家们发现孤雌激活来源的胚胎干细胞具有和供体母鼠完全相同的主 要组织相容性复合物。这也为这项技术应用于人类提供了实验基础。目前，已 纟圣成工力的从,J、鼠(Kaufman et al., t983)、兔(Wang et al,, 2007)、称猴(Cibelli et al., 2002; Vrana et al., 2003)以及人(Lin et al.， 2007; Mai et al.， 2007; Revazova et al., 2007a; Revazova et al.， 2007b)等哺乳动物的孤雌激活的囊胚获得ESC系。利用孤雌胚胎建立ESC的优点是建系效率高，伦理学争议少。 人类基因组DNA有3Xl09bp其中10%是串联重复序列，称为卫星DNA 按重复片段的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星序列。其中重 复片段为2-7bp组成的称为微卫星，又称为短串联重复序列(Short Tandem Repeat,简称STR) (Edwards et al., 1991 )，不同人体基因组卫星DNA重复 单位的数目是可变的，因此形成极其复杂的等位基因片段长度多态性(Schafer and Hawkins, 1998; Carramolino et al.， 1997)。 一般认为，人类基因平均每6 10kb就有1个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因 座的丰富来源。在实践中，联合使用多个STR可以产生数以亿计的基因型组 合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，可以在很高概率水平上认定 嫌疑人以及进行亲缘关系鉴定。因此，STR基因座的PCR分型因其高灵敏度， 高效率的实用特点，目前已成为国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术 (Hallenberg and Morling, 2001)。基因组印迹是某些等位基因的表观遗传修饰，与胎儿发育异常及肿瘤生长 有关。在个体发育不同时期，基因组印迹状态不同。己有研究表明，鼠胚胎干 细胞基因组印迹异常或不稳定(Kirn JH， Auerbach JM， Rodriguez2Gomez JA et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal of Parkinson's disease, Nature, 2002, 418(6893): 50256.);但另一 组研究者则发现人和小鼠EG细胞的基因组印迹基本正常，这可能为胚胎干细 胞临床应用排除了 一大障碍(Humpherys D, Eggan K, Akutsu et al. Epigenetic instability in ES cells and cloned mice. Science, 2001， 293 (5527): 95297)。对印记基因、甲基化等表观遗传学变化在hES细胞(Bo Wen Sun, A. Cong Yang et al. Temporal and本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有两条活性Ｘ染色体的人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物，其特征在于： （ａ）该人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物的核型在１０代以前是“４６，ＸＸ”；从第２０代开始，部分细胞发生了一条活性Ｘ染色体的丢失，该细胞系的核型变成了嵌合体“４６，ＸＸ ／４５，Ｘ０”；随着代次的增加，４５，Ｘ０的分裂相比例增加；到了第３５代，核型为“４５，Ｘ０”，该细胞系的所有细胞都发生了一条活性Ｘ染色体的丢失； （ｂ）在第１５代核型“４６，ＸＸ”和第３０代核型“４６，ＸＸ／４５，Ｘ０”中没有失活的 Ｘ染色体存在，在Ｘ染色体失活的检测中，一直维持只有活性Ｘ染色体的状态，而没有发现有失活的Ｘ染色体的存在； （ｃ）该人孤雌胚胎干细胞系及其衍生物是通过以下步骤制备的： ａ．获得成熟的处于第二次减数分裂中期的卵母细胞； ｂ．激 活卵的第二极体排出，促使其雌原核加倍形成纯合二倍体，培养该激活的细胞，诱导该细胞成为含有可辨别的内细胞团和滋养外胚层的胚胎； ｃ．分离所述内细胞团，转入可抑制细胞分化的培养基中培养，使这些细胞保持未分化的多能状态，并传代、冷冻，经各种 方法鉴定，确认为孤雌胚胎干细胞系及其衍生物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙筱放，
申请(专利权)人：广州医学院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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