人角膜内皮细胞培养液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种人角膜内皮细胞培养液及其制备方法和应用。包括主要活性成份为蛋白含量占１０－２００μｇ／ｍｌ的牛角膜内皮细胞裂解液及含量占１０％的胎牛血清、青霉素和链霉素各１００Ｕ／ｍｌ其余用Ｄ／Ｆ１２基础培养液补足。方法：首先体外培养牛角膜内皮细胞；然后制备牛角膜内皮细胞裂解液，最后在无菌容器中配制即得。本发明专利技术首次将牛角膜内皮细胞裂解液制成细胞培养液并应用到人角膜内皮细胞的体外培养，能促进体外培养的人角膜内皮细胞大量扩增、维持角膜内皮细胞的形态特征、抑制细胞衰老和凋亡，并且更利于内皮细胞的传代培养。其中的原材料牛角膜内皮细胞来源丰富易于体外培养，培养液的制备方法简单，便于实施，有利于产业化，具有广阔的应用开发前景。

【技术实现步骤摘要】
人角膜内 鹏§#^^其制备方法和自默领域本发B邻步及一种用于体外i^"增人角膜内皮细胞的i歸液，特别涉及到以牛角膜内皮细WM 做为錢活賊份配带MA^膜内皮细膨^^其制备方法和卿。背景狱角膜内卿败comeal endothelial cdl， CEC)^&于角膜内面的单层细胞，其外贴后弹力层内临房7k在 维躺,明和 *能方面担负着觀的角色。当CEC功倉^feP章碍(如大泡性角鹏变、Fuch角膜 内皮营新良、内眼手术后内皮失代j磐)时，CEC不能再生仅靠周边正常内飾ffiT大術zR3let勤W员 失的细鹏;ts代偿作用，当超出其代偿能力时将严驟响正徵见功能。现今'角赔'是世界i^盲性 百嫉的主魏因，角膜移丰錢复明唯一^^的治疗手段，但目前鹏于角麟植的角膜 # 着严重 的供需矛盾，极大制约了角麟植手术的幵展，这一问题在我国尤为显著；并且角麟禾鉢后蹄一定 的排斥风险需长期用药以及术后视力不佳等不利因素。随着临床眼科学、生物学和材料^#^斗的飞速 ，角膜内皮移植賴跑织oa确M^解决这一问题的i^i径，为更多角膜盲患者带来了希望，但^J^两种方法顷利开展的关键是获得足够功倉証常的角膜内皮种子细胞。目前大量研離果显示体内雜多种调节因素抑制了角膜内飾胞的再生能力、 而且体外i薪角膜内皮细胞增殖困难，條功兽征常的角膜内皮种子细ii^源^m织a:程角腐勾建和角 膜内皮移s^广泛开展的最^ial^t—。以往ff^证实人角膜基质细胞条件培lm中含有基质细胞分泌的减S^纤^飾)3^fe长因子(bFGF)等能iSa角膜内皮细胞的增殖，而目前角膜内自胞i歸液中也多添 力口碱f械第翻胞生长因子(bFGF)、表j^fe长因子(EGF)或祌经生长因子(NGF)導MJa角膜内^l胞的 增殖，但是添加了战长因子的±^ 长邦^#角膜内皮细胞在其维持脇、抑伟iJ^^凋t^面未见有 明Mfig^。因此，探索人角膜内鄉胞的体外培养体系，寻找制^S其大量扩增、维持规则絲、綱'J 衰老凋亡的歸体系迫額睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是掛共一种人角膜内自膨薪^&其制备方法和应用，以弥补现有技术的不足。研^S:现与人角膜内卿胞相比，牛角膜内卿胞在体外容易贴壁、增殖能力强、可以大量銜姐内皮细 态维持好，这正是人角膜内皮细胞体外i嫌所不及的。因ltKE人角膜内皮细胞的i錄体系中加入其中的活i^^^^角膜内鄉胞W^，以超胎詢對^4人角膜内皮细胞体外培养^&i殖、维持MPJ,、 W^^老凋亡的目的。本专利技术以体外培养的牛角膜内，胞为原材料制备牛角膜内自 | 液，并以牛角膜内，M ^±^活|4^份配制一种人角膜内，胞体外土歸液，专门用于人角膜内自胞的体外培养。本专利技术包括主要活|!^￡份蛋白#*占10"200^ml的牛角膜内鹏WM以及缝占10%的胎牛 血清、青霉薪口,素各100U/ml其余用D/F12寂股^^补足于无菌容器中配第,成，其中牛角膜内 卿 的蛋白浓度雌为20掘Mg/ml。本专利技术的制备方法首先，体外土歸牛角膜内鄉胞；其次，帝iJ拼角膜内飾JMM， ；R/g用 主要活(^K份蛋白賴占10-200^g/ml的牛角膜内鄉 、賴占10%的胎牛血清、青霉素和链 霉素各100UM其余用D/F12凝出i^t补^e制j^专利技术，即人角膜内鄉Sli^^。本专利技术的特点是在人角膜内,胞体外^##过程中能{ *^外人角膜内， 殖、维,膜内皮 细胞的规则條、抑制人角膜内皮细胞的鼓、凋亡，倉^^鹏高人角膜内鄉胞体外i歸的驢 和质量。因此，本专利技术在体外i^g^人角膜内鹏^ffl方面有显著的交媒，育^^她iSS^外培养人 角膜内皮细胞的增殖，并能^! 鹏隹持人角膜内,胞的形东。本专利技术的带恪方法鄉骤如下步骤一、首5fe^外:t錄牛角膜内皮细胞；步骤二、再制齢角膜内卿SfelM，蔬用主要活性 成份蛋白含量占10-200pg/ml的牛角膜内皮细ra鞭、含量占10%的胎牛血清、青霉素和 素各 100U/ml其余用D/F12基础if^^补足配制成，以专门用于体外i^^人角膜内卿胞。 其中步骤一(1) /AJ1宰场获取芋賴羊牛B艮球，去離艮球外附带的组织xjg，用PBS冲洗牛眼球，以去除牛眼球上的残 繊只；(2) a种眼鄉A^净工作台内，PBS再次浙躯MA含1000U/ml妥布霉^7K中浸泡10-15倂中，取 出后再用PBS冲洗牛眼球，以去除牛眼球上残余的妥布霉素；(3) 用无菌0艮科剪沿角膨彖!Tf牛眼球的角膜片，用DMEM-富糖型基础i錄液冲洗，再把角膜片内皮 面向iS于i歸皿中，在解剖显微镜下沿角IM^取下角斷上带有内皮细胞的后弹力层，再鹏弹 力层上的内鹏胞面向下贴于另一培养皿内，待战内皮细鹏占牢后，#^加少许含量占10%的胎 牛血清和2ngtol bFGF的DMEM-富糖型i:歸液于i歸皿中浸版弹力层，在37°C、 CO2浓度为 5%的斜牛下常规土鎌以得到原代牛角膜内皮细胞；或者是将取下的带有内鄉胞的后弹力层直接 方JfA含量占10%的胎牛血清和2ngto! bFGF的DMEM-^M型i^^中过夜，第二天离心去上清 液，力口入浓度为0.02g/ml的EDTA消化液37'C消化1小时，再离心去上清液，蹄加含量占10% 的胎牛血清和2ng/mlbFGF的DMEM-高糖型:fel^液吹打自胞悬液，并移Ai^皿内常规i^牛角膜内皮细胞；(4) 次日向i錄皿中补力n^M占10%的胎牛血清和2ng/ml bFGF的DMEM-Slt型;^^t,每3天魏 一次J^^皿中的i^im，待原代牛角膜内自 ^:^#皿面积的80%以上，即可对m^代牛角膜 内鹏鹏行銜#緣(5) 传^ffl浓度为0.125g/ml的月,B浓度为0.02g/ml的EDTA消化^37。C、 。02 为5%的^|牛 下消化贴壁的牛角膜内細胞，5^+后〗种角膜内鹏 ^个圆形细胞时，再用鍾占10%的 胎牛血激^# 止消化、并蝶牛角膜内皮细胞悬液，1000ipm离心5溯、去上清液、力D^1: 占10%的胎牛血清和2ng/ml bFGF的DMEM-寓糖型ig^S，按照1:1^# 3&1传为24 i^皿 细胞量的比例传代于直径9cm :tg^皿内常挪歸，以得到足够量的牛角膜内^ffl)Kafi^i旨角步fc、制糾角膜内皮细MM(1) 将J^銜tt錄的牛角膜内鄉胞，用PBS冲鄉胞二次，再用離为0.125gM的JRSIff鹏为 0.02^ml的EDTA消化職37。C、 CO2浓度为5%的割牛下消化贴壁的牛角膜内皮细胞，5 ^H+后 寸种角膜内卿M^个圆形细胞时，再用籠占l(f/。的胎牛血清i^S终止消化、并收集牛角膜 内鹏胞悬液；(2) 1000ipm离心5^H中去上清液，加入D/F12基石股gf^S轻吹打鹏脱悬液，同法重复3次以去除 其中的胎牛血清成份，最后再加足量的凝出il^SD/F12以重悬牛角膜内皮细胞，如对^#^直径 9跡的歸皿消化下来的细鹏n 10mlD/F12(3) 再将牛角膜内Mfl胞悬M-20。C冷冻30併中后37。C解冻，如此反复3次以使牛角膜内鄉胞充 分纖；(4) 以0.22,滤器滤除战牛角膜内皮细鹏鞭中的细胞碎片，即得至件角膜内皮细MM，留 取lml样本待用BCA蛋白试剂激则其蛋白含量；雖在无本文档来自技高网...

【技术保护点】
人角膜内皮细胞培养液，其特征在于该培养液包括主要活性成份为蛋白含量占１０－２００μｇ／ｍｌ的牛角膜内皮细胞裂解液以及含量占１０％的胎牛血清、青霉素和链霉素各１００Ｕ／ｍｌ其余用ＤＭＥＭ／Ｆ１２基础培养液补足于无菌容器中配成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：史伟云，高彦，周庆军，杨玲玲，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]