运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法，是将钩端螺旋体主要外膜蛋白ＯｍｐＬ１、ＬｉｐＬ２１和ＬｉｐＬ３２的优势Ｔ细胞和Ｂ细胞抗原表位串连后，亚克隆到表达载体并转化大肠杆菌构建工程菌，经ＩＰＴＧ诱导高效表达，表达菌的超声裂解上清纯化后包被微孔板，构建抗体检测ＥＬＩＳＡ试剂盒，同样地将上述纯化的重组抗原点样ＮＣ膜上，构建胶体金检测试纸条。检测抗体是钩体病人血清中的ＩｇＧ或ＩｇＭ。本发明专利技术可用于检测能在人类和其它动物体内引起疾病的钩端螺旋体感染，包括具有兽医学重要性的那些钩端螺旋体的感染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学免疫检测学
，特别地，涉及一种运用重组多表位 肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法。
技术介绍
钩端螺旋体病是一种由钩端螺旋体菌感染而产生的动物传染性疾病通过 接触家养或野生的动物宿主或被它们尿液所污染的环境而传播给人。钩端螺旋 体由8种致病的遗传相异类型和4种非致病的腐生种类组成。钩端螺旋体还按血清型情况进行了分类，目前已鉴定出了 230多个致病血清变型。钩端螺旋体病广泛分布于世界各地。由于大范围的动物物种可作为其宿主， 所以该病被认为是最普遍的人畜共患疾病。该病的早期特征为发热、寒战、头 痛和严重的肌肉痛，由于症状与出血热、感冒等相似而常被误诊。在临床感染 中有5-15%的病人病情发展至产生诸如黄疸、肾机能不全和肺出血等严重的多 系统并发症。严重的钩端螺旋体病死亡率为5-50%。最近几年该病已出现了新的传播模式，突出显示了钩端螺旋体病正成为公 共健康问题的严重性。在发达国家，钩体病成为消遣性活动和体育运动相关性 疾病发作的原因。在发展中国家，贫困状况已造成了高死亡率钩体病在城市或 乡村的广泛传播。不仅如此，钩体病还造成牛、猪、羊、马和狗等牲畜和家养 动物的流产、死产、不育、不生长、产奶量低甚至死亡。目前适当检测工具的缺乏阻碍了对人和动物钩体病的控制。虽然经过数十 年的努力，在钩端螺旋体病的科研和防治方面己取得了一定的成就，但目前钩 体检测方法主要有直接暗视野显微镜检查法、改良镀银染色法、凝集试验及凝 集素吸收试验等。但这些方法不适合急性病例的鉴别。新发展的基于全细胞钩 端螺旋体抗原制品的酶联免疫吸附检测法(ELISA)和其它快速血清学检测仍需 要进行MAT以确认病例。钩端螺旋体病的发病机理依赖于感染早期病原体在宿 主体内广泛散布的能力。钩体外膜蛋白被认为介导了使其能穿过并散布于宿主组织间的相互作用。此外，外膜蛋白在宿主感染期间可引发免疫反应，因此构 成了通过抗体依赖型吞噬作用和补体介导型致死作用等机制而进行免疫保护的 耙分子。最近有利用重组外膜蛋白作为钩端螺旋体病的血清学检测的方法，但 由于钩端螺旋体的抗原结构复杂，血清型众多，用常规的以多抗血清为基础的 血清学方法不利于该病的早期快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种运用重组多表位肽蛋白 进行钩端螺旋体感染检测的方法
本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的 一种运用重组多表位肽蛋白 进行钩端螺旋体感染检测的方法，采用钩端螺旋体外膜蛋白优势抗原决定簇的 重组多表位肽为检测抗原构建试剂盒或试纸条，检测钩端螺旋体抗体IgM或IgG。进一步地，它包括以下步骤-(1) 筛选钩端螺旋体外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的优势抗原表位；(2) 根据筛选的表位序列及表达系统的偏爱性，人工合成DNA序列并采用基因 工程手段获得目的蛋白的编码基因；(3) 将合成的基因片段克隆到表达载体中并构建表达该目的蛋白的表达系统；(4) 根据表达系统的特点选用一定的纯化方法提纯目的蛋白并获得高纯度的# 口 广叩s(5) 对所述步骤(4)获得的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，确定具有22 kD分 子量的特定蛋白存在；对目标蛋白进行Western Blot分析，确定所获得 蛋白的免疫反应性。(6) 以获得的重组蛋白为抗原，构建ELISA检测试剂盒或试纸条，检测目标样 品中抗钩体IgG或IgM的存在情况而实现对钩体病人的检测。进"步地所述的目标样品为人或动物的血清、脑脊液等所有已经脱离人体 或动物体的体液样品；所述的用于钩端螺旋体感染检测的方法是在体外进行的。本专利技术的有益效果是本专利技术用多表位串连表达蛋白作为抗原进行钩体病 血清学检测具有特异、快速、方便、灵敏正确、结果可肉眼观察等特点，且该 检测方法没有钩体不同血清型的限制，有利于其推广应用。附图说明4图1为重组质粒的酶切图谱，图中，Ml， 50 bp DNA marker; 1， pBacPAK8/BamHI+EcoRI; 2， pBacPAK8-Imp/ BamHI+EcoRI; 3， pBacPAK8-21mp/ BaraHI+EcoRI; 4， pET28a/BamHI+EcoRI; 5， pET28a-21mp/BamHI+EcoRI; M2， 1 kb DNA marker。图2为目的蛋白的SDS-PAGE分析图，图中，M， protein ladder: 1， pET28a; 2-3， pET28a-21mp超声波破碎上清；4-5， pET28a-21mp超声波破碎沉淀；6-7， 2 Imp纯化。图3 Western Blot分析结果图，图中，1， 2， 3，分别为pET28a， pET28a-21mp， 21mp purification与抗体的杂交条带。 图4检测试纸条的设计图。具体实施例方式本专利技术通过基因工程手段，将钩端螺旋体外膜蛋白0mpLl、 LipL21、 LipL32 的优势抗原表位进行串连，通过表达系统在体外进行表达、纯化、并制备钩端 螺旋体菌的抗体检测试剂盒。该试剂盒能特异性地检测钩端螺旋体菌的抗体， 能检测不同血清型钩体感染后造成的感染，可用于钩端螺旋体病的临床血清学 检测及环境钩端螺旋体菌的监测。本专利技术的方法包括以下步骤1. 筛选钩端螺旋体外膜蛋白0mpLl、 LipL21和LipL32的优势抗原表位；2. 根据筛选的表位序列及表达系统的偏爱性，人工合成DNA序列并采用基因工 程手段获得目的蛋白的编码基因；3. 将合成的基因片段克隆到表达载体中并构建表达该目的蛋白的表达系统；4. 根据表达系统的特点选用一定的纯化方法提纯目的蛋白并获得高纯度的产n5. 对上述(4)所获得的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，确定具有22 kD分子量的特 定蛋白存在；对目标蛋白进行Western Blot分析，确定所获得蛋白的免疫反应性。6. 以获得的重组蛋白为抗原，构建ELISA检测试剂盒或试纸条，检测目标样品 中抗钩体IgG或IgM的存在情况而实现对钩体病人的检测。其中，目标样品为人或动物的血清、脑脊液等所有已经脱离人体或动物体 的体液样品；该方法在体外进行。实施例1. T细胞和B细胞优势抗原决定簇的筛选通过 Propred HLA-DR 结合肽预测工具 ProPred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred/) 以及 EMBOSS 软件包 (http:〃bioinfo. hku. hk/EMB0SS/)分别预测了钩端螺旋体外膜蛋白OmpLl、 LipL21和LipL32的主要T细胞和B细胞抗原表位。将预测的表位片段通过PCR 方法扩增后插入到噬菌体M13KE中在PIII蛋白表面进行展示，纯化噬菌体蛋白 并对各筛选表位进行鉴定。实施例2.包含多表位肽载体的构建根据表达系统密码子偏爱性，人工合成了各表位片段串连基因lmp，其中各 表位之间通过柔性肽段进行连接，在合成基因的两端分别含有BamHI、 BglII和 EcoRI位点，将合成的基因插入到pUC57载体中构建p-l即载体，测序正确后通 过BamHI和EcoRI酶切分离Imp基因，并插入到BglII和EcoRI酶切的p-Imp 载体中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种运用重组多表位肽蛋白进行钩端螺旋体感染检测的方法。其特征在于，采用钩端螺旋体外膜蛋白优势抗原决定簇的重组多表位肽为检测抗原构建试剂盒或试纸条，检测钩端螺旋体抗体ＩｇＭ或ＩｇＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林旭瑷，陈寅，严杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]