特异结合蓖麻毒素的肽、其编码核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法技术

本发明专利技术公开了特异结合蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。优选地，本发明专利技术的肽具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１－１２任何一个所示的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及特异结合蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。
技术介绍
蓖麻毒素(ricin，RC)是从大戟科植物蓖麻种子中提取出的一种植物蛋白。它是植物凝集素王国中的一员，而大多数凝集素能与碳水化合物结合，并具有毒性。这些凝集素可分为两类，一类为RIP I型(ribosome-inactivating protein type I)，是单链蛋白，包括有天花粉蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白等；另一类为RIP II型，包括有相思豆毒素、蓖麻毒素、槲寄生毒素等。RIP II型的A链与RIP I型结构、作用相似，序列分析两者均有高度保守区域。蓖麻毒素属于RIP II型，由A、B两条链组成。A链有263个氨基酸，具有N-糖苷酶活性，能水解真核细胞28S rRNA第4323位上的腺嘌呤，使真核细胞60S核糖体失活而抑制蛋白质合成。B链有259个氨基酸，能与半乳糖残基相结合。A、B两条链靠二硫键连接从而形成完整的蓖麻毒素。蓖麻毒素是最强的植物毒素之一，一分子A链一分钟之内就可使几千个核糖体失活，小鼠的LD50为约1μg/kg。由于蓖麻毒素在抑制蛋白质合成的同时，还能引起炎症反应，释放细胞因子如白介素、TNFα，以及诱导肝癌细胞合成一氧化氮合酶等，所以，蓖麻毒素还能用作药物，特别是癌症的治疗。但由于其毒性过强，限制了它的广泛应用，为此，对蓖麻毒素修饰物的研究也在不断进行，以期降低毒性作用，而保留它的抗肿瘤活性。蓖麻毒素毒性强，难于检测，至今未发现其天然拮抗剂，因此中毒后很难救治。为此科研人员通过不同的方法对它的拮抗剂进行了研究，其中一种方法是借助计算机进行的。从蓖麻毒素的晶体衍射证明，A链形成的与核糖体RNA结合的活性部位具有一定的刚性，且只与腺嘌呤环状底物类似物如喋呤酸、间型霉素等结合，活性部位中的重要基团有Tyr80，Val81，Tyr123，Glu177，Arg180，这样为寻找蓖麻毒素的拮抗剂提供了思路。总之，本领域需要检测和拮抗蓖麻毒素的物质和方法。因此，本专利技术的目的是要提供新的用于检测和拮抗蓖麻毒素的肽、编码它们的核酸、以及检测和抑制蓖麻毒素的方法。
技术实现思路
专利技术人通过噬菌体展示随机肽库技术筛选到一些新的特异结合蓖麻毒素的肽，由此完成本专利技术。因此，一方面，本专利技术涉及一种分离的肽，其含有选自下列组的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1-12任何一个所示的氨基酸序列；(b)(a)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并具有特异结合蓖麻毒素的活性；和(c)与(a)或(b)序列有至少90％同源性、并能特异结合蓖麻毒素的序列。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多核苷酸，其含有选自下列组的序列(a)编码本专利技术的肽的核苷酸序列；(b)在中度严紧或高严紧条件下可与(a)序列杂交、并基本保持(a)序列的活性的序列；(c)(a)或(b)序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并基本保持(a)或(b)序列的活性；(d)与(a)或(b)的序列有至少约90％同源性的序列；和(e)以上序列的互补序列。优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID NO13-24任何一个的核苷酸序列。本专利技术还涉及含有上述多核苷酸的序列的载体。优选地，本专利技术载体是能够表达本专利技术多核苷酸的表达载体。本专利技术还涉及转化或转染了本专利技术载体的宿主细胞，例如真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞，和原核细胞，如大肠杆菌细胞。本专利技术进一步涉及含有上述肽的融合蛋白。本专利技术还涉及用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的组合物，其含有至少一种本专利技术的肽。另一方面，本专利技术还涉及检测蓖麻毒素的方法，包括将本专利技术的肽、本专利技术的融合蛋白和/或本专利技术的组合物与待测样品接触；测定本专利技术的肽、本专利技术的融合蛋白和/或本专利技术的组合物结合蓖麻毒素形成的复合物的量；并将该量与标准曲线进行比较，以检测待测样品中蓖麻毒素的量。另一方面，本专利技术还涉及抑制蓖麻毒素毒性的方法，包括给予对象(例如，含有蓖麻毒素的样品、细胞等)有效抑制蓖麻毒素毒性量的本专利技术的肽(优选SEQ ID NO3、5、8、12)、本专利技术的融合蛋白和/或本专利技术的组合物。本专利技术还涉及本专利技术的肽、本专利技术的融合蛋白或本专利技术的组合物用于检测蓖麻毒素或抑制蓖麻毒素毒性的用途。在参考下列详述和附图后，本专利技术的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。附图说明图1显示的是各噬菌体克隆的ELISA检测结果。图中“P/N比”表示包有蓖麻毒素孔的OD450(P)与空白对照孔的OD450(N)的比值。具体实施例方式这里所用术语具有本领域所公知的通用的含义。本领域技术人员将明了，多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。多核苷酸可以含有天然序列(即编码本专利技术肽或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体、或生物学或抗原功能等同物。正如以下进一步描述的，多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，优选地，以致所编码的肽的免疫原性相对于天然肽不减少。一般可以按本文所述方法评价对该编码肽的免疫原性的影响。术语“变体”也包括异种来源的同源基因。为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对Smith和Waterman的局部同源性算法((1982)Add.APL.Math2482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。适合于确定序列同源性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本专利技术的多核苷酸和肽的序列同源性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。因此，本专利技术包括与本文所公开序列基本同源的多核苷酸和肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析，描述如下)时，与本专利技术多核苷酸或肽序列相比含有至少50％序列同源性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同源性的那些序列。本领域技术人员将明了，考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框的定位等，可以对这些值进行适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同源性。在其它实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的肽，其含有选自下列组的氨基酸序列：（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１－１２任何一个所示的氨基酸序列；（ｂ）（ａ）序列的变体序列，它含有一个或多个插入、缺失、添加、或替代，并具有特异结合蓖麻毒素的活性；和（ｃ） 与（ａ）或（ｂ）序列有至少９０％同源性、并能特异结合蓖麻毒素的序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王亚丽，李前，王玉霞，邵宁生，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]