间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法技术

一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其操作程序是：分析马动脉炎病毒ＧＬ蛋白的抗原性，设计引物并克隆ＧＬ蛋白的抗原域编码基因，构建ＧＬ蛋白表达载体ｐＥＴ－ＧＬ１，将ｐＥＴ－ＧＬ１质粒转化ＢＬ－２１宿主菌，高效表达ＧＬ蛋白，纯化重组ＧＬ蛋白作为检测抗原，建立了检测马动脉炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ｉＧＬ１－ＥＬＩＳＡ）。ｉＧＬ１－ＥＬＩＳＡ与病毒中和试验、西班牙ＩＮＧＥＺＩＭ－ＡＲＴＥＲＩＴＩＳ试剂盒的检测结果符合率分别达到９４．１％、９５．６％。ｉＧＬ１－ＥＬＩＳＡ方法检测马动脉炎病毒，特异性好、灵敏度高，可提高检测效率，降低检测成本，具有很强的推广性和实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是属于马动脉炎病毒感染的检测技术，是一种采用间接酶联免疫吸附试验的检测方法。
技术介绍
马动脉炎病毒(Equine Arteritis Virus，EAV)是马病毒性动脉炎的病原，马病毒性动脉炎是引起马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染病，可导致病变器官的小动脉中膜变性和坏死。国际兽疫局(OIE)将马病毒性动脉炎列为B类传染病，我国农业部宣布其为禁止进境的二类动物传染病。马动脉炎病毒为套式病毒目(Nidoviales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员。1953年美国专家Doll等首次从马流产胎儿中分离出该病毒，并命名为Bucyrus株。EAV是线性单股正链RNA病毒，含有七个ORF(开放阅读框架)，编码四种结构蛋白核衣壳蛋白N、膜蛋白M、大囊膜糖蛋白GL和小囊膜糖蛋白Gs。大囊膜糖蛋白GL含有EAV最主要的中和抗原决定簇，是EAV的主要保护性抗原，GL蛋白和M蛋白通过二硫键形成二聚体复合物，是病毒颗粒的主要组成单位。在EAV流行地区，马匹一般呈隐性感染或出现比较轻的感染症状，如果在牧场发生流行可造成妊娠母马的高流产率。持续感染的种公马虽然没有明显的临床症状，但是精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病呈世界性分布，血清学试验证实，中国也存在此病。由于目前还无法区别自然感染产生的抗体和免疫接种产生的抗体，许多国家为了出口的需要，禁止使用疫苗接种来控制本病。本专利技术在做出之前，对马动脉炎病毒的检验检疫方法，世界动物卫生组织(OIE)规定其方法包括血清中和试验、补体结合试验、血凝和血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。血清中和试验(SNT)动物受到病毒感染后，体内产生特异性的中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验是以测定病毒的感染力为基础，比较病毒受免疫血清中和后的感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试验常用的有两种方法一种是固定病毒量与等量系列稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释的病毒混合；然后把血清-病毒混合物置适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清-病毒混合物的宿主与对照一样都出现病变或死亡，则说明血清中没有相应的中和抗体。中和试验不仅能定性而且能定量。补体结合试验(CFT)补体是一组正常血清蛋白成分，可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或抗原，称作补体结合试验(complement fixation test，CFT)。CFT包括两种系统，第一个为反应系统，已知抗原(抗体)，被检血清(或抗原)和补体。第二个系统为指示系统(又称溶血系统)，即溶血素+绵羊红细胞，溶血素即为抗绵羊红细胞抗体，补体常用豚鼠血清，它对红细胞有较强的裂解能力。但补体只有和抗原抗体复合物结合后被激活才能够产生溶血作用。因此，如果试验中的抗原和抗体是对应的，形成免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于没有游离的补体，就不产生溶血现象，即为阳性反应。反之试验中缺乏抗原或特异性抗体，就不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，就被指示系统，即绵羊红细胞和溶血素免疫复合物激活，而出现溶血，即阴性反应。血凝和血凝抑制试验其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是简单快速，但是由于它检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。该酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判断有无相应的免疫反应，颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原的量成呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪(酶标仪)来测定。上述方法因敏感性、特异性、确诊时间过长或环境污染等问题，很难满足进出口贸易中快速、敏感、特异、经济的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用间接酶联免疫吸附试验的检测技术，建立一种敏感、特异、快速、准确的检测方法，并应用于马动脉炎病毒的检验检疫，以提高检测方法的敏感性、特异性，缩短检测时间，降低检测成本，保护和促进我国畜牧业和对外贸易的发展。本专利技术是按以下技术方案完成的，其检测方法是分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因，构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1，将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白，Western-blot鉴定表达产物，表达产物的大小约为26kD，His-Bind柱纯化蛋白，优化马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA方法的反应条件，并建立结果判断的标准，分析该检测方法的特异性，对待检血清分别用间接酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS试剂盒这3种方法进行检测，比较检测结果的符合率。分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性根据GenBank上登陆的EAVBucyrus的基因序列(NC-002532)，应用DNAstar软件分析GL蛋白的抗原性，结果表明GL蛋白54Aa-98Aa抗原指数较高。设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因用Primer 5.0软件设计引物，目标扩增基因为EAV GL蛋白的54Aa-98Aa区域。在引物P1中加入Bam HI酶切位点，引物P2中加入Xho I酶切位点。引物序列为P15′-CGTGGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′，划线部分是Bam HI酶切位点； P25′-ATACTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′，划线部分是Xho I酶切位点。取病毒悬液，提取总RNA，进行逆转录反应。取5μL反转录产物为PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用胶回收试剂盒回收。构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1将回收的目的片段和pET-32a质粒分别用Bam HI、Xho I酶切，用胶回收试剂盒回收纯化的目的产物。将目的片段和载体按用T4DNA连接酶连接。氯化钙法制备BL21(DE3)感受态细胞，转化连接产物。自氨苄(Amp)平板上挑取单菌落，接种于LB培养基，37℃震荡培养14-16h，碱裂解法提取质粒用Bam HI和Xho I双酶切鉴定。将阳性质粒命名为pET-GL1，测序。将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白将阳性转化菌接种于含50μ/mL Amp的LB培养基37℃震荡培养过夜。次日以2％的量接种于2×YT培养基(50μ/mL Am本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于它的程序是：分析马动脉炎病毒ＧＬ蛋白的抗原性，设计引物并克隆ＧＬ蛋白的抗原域编码基因，构建ＧＬ蛋白原核表达载体ｐＥＴ－ＧＬ１，将ｐＥＴ－ＧＬ１质粒转化ＢＬ－２１宿主菌，高效表达ＥＡＶＧＬ蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定表达产物，Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ柱纯化蛋白，优化马动脉炎病毒抗体的ｉＧＬ１－ＥＬＩＳＡ方法的反应条件，建立判定结果的标准，分析该检测方法的特异性，对待检血清分别用间接酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、以及西班牙的ＩＮＧＥＺＩＭ－ＡＲＴＥＲＩＴＩＳ试剂盒这３种方法进行检测，比较检测结果的符合率。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁成珠，岳志芹，朱来华，高宏伟，吴华，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]