氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒，利用谷氨酸脱氢酶与α－酮戊二酸、还原型辅酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶将谷氨酸变回氨及α－酮戊二酸，使氨不断地被循环利用，并不断地扩增产生过氧化氢，再由过氧化物酶与过氧化氢及还原型色原体组合作用，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，利用可见光分析仪器，在４００～７００ｎｍ波长处测定染料吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收大小，通过测量４００～７００ｎｍ处吸光度上升的程度，得出氨浓度的大小。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响。本发明专利技术可以通过紫外／可见光分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药、食品、环境等领域内对氨浓度的检测，尤其涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定氨浓度的方法，以及由此制得的氨诊断试剂盒，属于氨浓度分析检测

技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定氨浓度的方法，以及应用该方法配制而成的氨诊断试剂盒。本专利技术的原理是利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)来测定氨的浓度，其主要技术路线是采用谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作为作用酶，产生谷氨酸，谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)作为循环酶，功能为将谷氨酸再次变回氨及α-酮戊二酸，使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地扩增产生过氧化氢，过氧化物酶的作用是显色酶，它将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400～700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)含量高低的光吸收大小，通过测量400～700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度，得出氨浓度大小测定结果。为实现本专利技术的目的，一种测定氨浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、还原型辅酶、还原型色原体组合和过氧化物酶的试剂混匀，使之发生以下反应 然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测400～700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收程度，测算得出样品中氨浓度大小。上述酶循环扩增法测定氨浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。上述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合 实现本专利技术氨诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂/试剂总体积 1～50％，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，谷氨酸脱氢酶 2000～500000U/L，谷氨酸氧化酶 2000～500000U/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L，过氧化物酶500～500000U/L，还原型色原体组合 0.1～20mmol/L。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、还原型色原体组合成分之一、过氧化物酶等，可以放在试剂II；试剂II中的谷氨酸氧化酶、还原型色原体组合成分之二也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将试剂配成如下三试剂 与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的α-酮戊二酸、还原型辅酶、还原型色原体组合成分之一、谷氨酸脱氢酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的过氧化物酶、还原型色原体组合成分之二可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的谷氨酸氧化酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在1％～50％(V/W)范围之内。用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本专利技术的优选方案 缓冲液 100mmol/L，稳定剂/试剂总体积 50％，还原型辅酶 0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 100000U/L，谷氨酸氧化酶 8000U/L，α-酮戊二酸16mmol/L，过氧化物酶 30000U/L，还原型色原体组合 6mmol/L。利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400～700nm波长处吸光度的上升，得以测定氨浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的氨诊断/检测试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本专利技术完全利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定氨浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用； (5)应用本专利技术提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中氨浓度的大小；(6)本专利技术提供的液态氨诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。具体实施例方式本专利技术一种氨浓度的测定方法及氨诊断试剂盒，利用谷氨酸脱氢酶与α-酮戊二酸、还原型辅酶生成谷氨酸，由谷氨酸氧化酶将谷氨酸变回氨及α-酮戊二酸，使氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
氨浓度的测定方法，包括以下步骤：①将待测样品与含有α－酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、还原型辅酶、还原型色原体组合和过氧化物酶的试剂混匀，使之发生以下反应，氨＋α－酮戊二酸＋还原型辅酶＊谷氨酸＋辅酶＋水谷氨酸＋ 水＋氧＊氨＋α－酮戊二酸＋过氧化氢过氧化氢＋还原型色原体组合＊吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水②将反应混合物置于紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪下，检测４００～７００ｎｍ处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸 收程度，测算得出样品中氨浓度大小。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]